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【摘 要】从西藏不同地区藏鸡场无菌采取疑似大肠杆菌病死鸡的肝、脾、肺等病料， 进行了大肠杆菌病原菌的分离、培养与鉴定。同时，结合临床症状及病理变化， 证实为鸡大肠杆菌病，从不同地区的鸡场共分离出4株大肠杆菌，为以后掌握藏鸡大肠杆菌病的流行情况提供理论依据。
【关键词】西藏；鸡；大肠杆菌；分离与鉴定
西藏自治区是全国五大牧区之一，藏鸡是具有体形小、匀称紧凑、胸腿部位肌肉发达、生长较快等特点[1]。近年来，藏鸡养殖业得到了迅猛发展。由于藏鸡生存于低压、缺氧高海拔地区，传染性疾病相对较少。但是，藏鸡细菌病较为多发，尤其藏鸡大肠杆菌病较为多见。
鸡大肠杆菌病是以接触性感染为主的细菌性疾病，在兽医临床上，雏鸡常表现为脐炎、急性败血症等，成年鸡却表现为气囊炎、肝周炎、输卵管炎等[2]。随着藏鸡养殖业的迅速发展和规模的不断扩大，该病已成为养鸡场的常见多发病，常引起较高的发病率和死亡率，严重制约了养殖业的发展。为了及时掌握西藏地区藏鸡大肠杆菌的流行情况，本试验通过发病的4个鸡场的病死鸡进行了病原分离、培养与鉴定，旨在为西藏地区藏鸡大肠杆菌病的防治工作提供理论依据。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
从西藏地区某4个养殖场采集的症状明显的病死鸡组织，分离出4株藏鸡大肠杆菌，分别标记为（L1，L2，Z1，S2）。
1.1.2 发病表现及剖检
对西藏地区4个发病明显鸡场的病死鸡进行采样，对其外观进行检查，而后进行剖检，根据剖检病理变化，初步判断为大肠杆菌病。
1.1.3 培养基
麦康凯培养基（杭州天和微生物技术有限公司），MH肉汤（青岛高科园海博生物有限公司），营养肉汤培养基（北京奥博星生物技术有限公司），SS琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司），血琼脂培養基（郑州贝瑞特生物技术郑州有限公司），生化鉴定管（杭州微生物试剂有限公司），均在有效期内。
1.1.4 仪器
手提式蒸汽消毒器（上海医用核子仪器厂），隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）、90-1磁力搅拌器（上海亚荣生化仪器厂）、电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、超净工作台 （苏州净化设备公司），微量移液器（上海求精生化有限公司），DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）等。
1.2 方法
1.2.1 病料涂片染色镜检 将病料进行触片，进行革兰氏染色，而后镜检。
1.2.2 培养基的制备 按照培养基的说明书进行配制。
1.2.3 细菌的分离与纯化 无菌条件下，从病死鸡的肝脏上取病料划线接种于血琼脂培养基上，置37°C恒温培养箱中过夜培养，用接菌环挑取单个菌落接种于营养肉汤培养16h后，再于麦康凯平板、SS平板上进行划线37°C培养16h后，观察菌落大小及形态。
对细菌进行二次纯化，挑取在麦康凯培养基上生长为圆形的粉红色菌落，挑选单个菌落钓入营养肉汤，置恒温箱中培养16h后，作为受试菌株。
1.2.4 细菌的鉴定 将纯化后的细菌在大肠杆菌显色培养基上进行鉴别，无菌操作，从菌液中钓一环菌液于大肠杆菌显色培养基上划线，置37°C恒温培养16h，观察结果，共分离收集藏鸡大肠杆菌4株。
1.2.5 生化试验 用灭菌接种环勾取少许纯培养物接种于各种生化微量鉴定管中，石蜡封口后，37℃培养18h后观察结果。
2、结果与分析
2.1 涂片染色镜检结果
触片进行革兰氏染色，镜检发现待检菌株呈现革兰氏阴性、散在的小杆菌。
2.2 细菌的分离培养结果
分离的菌株经37°C培养16h后，在麦康凯琼脂培养基上生长为粉红色、圆形、光滑、边缘整齐、中央隆起的菌落；在血琼脂平板上形成圆形凸起、光滑、湿润、灰白色菌落；而在SS琼脂培养基上生长为白圈黑心、圆形、光滑的菌落。
2.3 细菌的培养鉴定结果
藏鸡大肠杆菌在大肠杆菌显色培养基上呈淡蓝色，圆形，隆起，光滑，湿润的菌落，不呈现蓝色的菌落为非大肠杆菌或有杂菌，须再次进行纯化培养、鉴定。
2.4 生化试验鉴定结果
本试验生化结果显示，此次分离的菌株符合大肠杆菌的生化反应特性。
3、讨论
本试验通过对病料的染色镜检、分离培养及细菌形态观察等一系列过程将病原菌株初步确定为大肠杆菌后，再把分离的细菌进行生化试验，这些特征符合大肠杆菌的生化反应特性。
当前，禽类大肠杆菌疾病是危害养禽业的重要病原菌，凡是能引起机体抵抗力降低的因素，例如饲养环境差、光照不足、通风不良、饲养密度大、没有定期消毒及气候突变等因素均是引发本病的原因[3]。因此，防治本病的关键在于平时加强饲养管理，做好各个环节的卫生消毒，消除各种发病诱因。日常要提供全价饲料，并补充足量的维生素和电解质；夏季还要注意防暑；应添加饲料添加剂，如碳酸氢钠、杆菌肽锌、维生素C等；严格执行卫生防疫措施，创造一个良好的饲养环境[4]。
通过以上的试验可以看出，我们应该定期对鸡场的病原菌进行分离鉴定。同时，配合严密而准确的诊疗方法，才能取得较好的防治效果，才能从根本上控制或减少藏鸡大肠杆菌病的发生，争取把西藏地区藏鸡大肠杆菌病发生率控制在最低限度，最大限度地提高藏区牧民的经济效益，为西藏畜牧业健康快速发展、经济社会跨越式发展奠定基础。
参考文献：
[1] 严昌荣. 浅述藏鸡传染病的诊断与防治[J]. 中国畜禽种业， 2011， 6： 149-150.
[2] 孙朋. 徐州地区蛋鸡大肠杆菌病的诊治[J]. 家畜生态学报， 2011， 32（6）： 77-79.
[3] 郭伶， 代竹青. 一例鸡大肠杆菌的分离与鉴定[J]. 中国畜牧兽医， 2010， 37（1）： 184-185.
[4] 李本科. 鸡大肠杆菌的分离鉴定[J]. 山东畜牧兽医， 2012， 33（1）： 17-18.
作者简介：
刘保光（1983-），男，河南郑州人，硕士研究生，助教，主要从事动物细菌病药物治疗及动物药理学的教学与实验实践研究工作。
【关键词】西藏；鸡；大肠杆菌；分离与鉴定
西藏自治区是全国五大牧区之一，藏鸡是具有体形小、匀称紧凑、胸腿部位肌肉发达、生长较快等特点[1]。近年来，藏鸡养殖业得到了迅猛发展。由于藏鸡生存于低压、缺氧高海拔地区，传染性疾病相对较少。但是，藏鸡细菌病较为多发，尤其藏鸡大肠杆菌病较为多见。
鸡大肠杆菌病是以接触性感染为主的细菌性疾病，在兽医临床上，雏鸡常表现为脐炎、急性败血症等，成年鸡却表现为气囊炎、肝周炎、输卵管炎等[2]。随着藏鸡养殖业的迅速发展和规模的不断扩大，该病已成为养鸡场的常见多发病，常引起较高的发病率和死亡率，严重制约了养殖业的发展。为了及时掌握西藏地区藏鸡大肠杆菌的流行情况，本试验通过发病的4个鸡场的病死鸡进行了病原分离、培养与鉴定，旨在为西藏地区藏鸡大肠杆菌病的防治工作提供理论依据。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
从西藏地区某4个养殖场采集的症状明显的病死鸡组织，分离出4株藏鸡大肠杆菌，分别标记为（L1，L2，Z1，S2）。
1.1.2 发病表现及剖检
对西藏地区4个发病明显鸡场的病死鸡进行采样，对其外观进行检查，而后进行剖检，根据剖检病理变化，初步判断为大肠杆菌病。
1.1.3 培养基
麦康凯培养基（杭州天和微生物技术有限公司），MH肉汤（青岛高科园海博生物有限公司），营养肉汤培养基（北京奥博星生物技术有限公司），SS琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司），血琼脂培養基（郑州贝瑞特生物技术郑州有限公司），生化鉴定管（杭州微生物试剂有限公司），均在有效期内。
1.1.4 仪器
手提式蒸汽消毒器（上海医用核子仪器厂），隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）、90-1磁力搅拌器（上海亚荣生化仪器厂）、电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、超净工作台 （苏州净化设备公司），微量移液器（上海求精生化有限公司），DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）等。
1.2 方法
1.2.1 病料涂片染色镜检 将病料进行触片，进行革兰氏染色，而后镜检。
1.2.2 培养基的制备 按照培养基的说明书进行配制。
1.2.3 细菌的分离与纯化 无菌条件下，从病死鸡的肝脏上取病料划线接种于血琼脂培养基上，置37°C恒温培养箱中过夜培养，用接菌环挑取单个菌落接种于营养肉汤培养16h后，再于麦康凯平板、SS平板上进行划线37°C培养16h后，观察菌落大小及形态。
对细菌进行二次纯化，挑取在麦康凯培养基上生长为圆形的粉红色菌落，挑选单个菌落钓入营养肉汤，置恒温箱中培养16h后，作为受试菌株。
1.2.4 细菌的鉴定 将纯化后的细菌在大肠杆菌显色培养基上进行鉴别，无菌操作，从菌液中钓一环菌液于大肠杆菌显色培养基上划线，置37°C恒温培养16h，观察结果，共分离收集藏鸡大肠杆菌4株。
1.2.5 生化试验 用灭菌接种环勾取少许纯培养物接种于各种生化微量鉴定管中，石蜡封口后，37℃培养18h后观察结果。
2、结果与分析
2.1 涂片染色镜检结果
触片进行革兰氏染色，镜检发现待检菌株呈现革兰氏阴性、散在的小杆菌。
2.2 细菌的分离培养结果
分离的菌株经37°C培养16h后，在麦康凯琼脂培养基上生长为粉红色、圆形、光滑、边缘整齐、中央隆起的菌落；在血琼脂平板上形成圆形凸起、光滑、湿润、灰白色菌落；而在SS琼脂培养基上生长为白圈黑心、圆形、光滑的菌落。
2.3 细菌的培养鉴定结果
藏鸡大肠杆菌在大肠杆菌显色培养基上呈淡蓝色，圆形，隆起，光滑，湿润的菌落，不呈现蓝色的菌落为非大肠杆菌或有杂菌，须再次进行纯化培养、鉴定。
2.4 生化试验鉴定结果
本试验生化结果显示，此次分离的菌株符合大肠杆菌的生化反应特性。
3、讨论
本试验通过对病料的染色镜检、分离培养及细菌形态观察等一系列过程将病原菌株初步确定为大肠杆菌后，再把分离的细菌进行生化试验，这些特征符合大肠杆菌的生化反应特性。
当前，禽类大肠杆菌疾病是危害养禽业的重要病原菌，凡是能引起机体抵抗力降低的因素，例如饲养环境差、光照不足、通风不良、饲养密度大、没有定期消毒及气候突变等因素均是引发本病的原因[3]。因此，防治本病的关键在于平时加强饲养管理，做好各个环节的卫生消毒，消除各种发病诱因。日常要提供全价饲料，并补充足量的维生素和电解质；夏季还要注意防暑；应添加饲料添加剂，如碳酸氢钠、杆菌肽锌、维生素C等；严格执行卫生防疫措施，创造一个良好的饲养环境[4]。
通过以上的试验可以看出，我们应该定期对鸡场的病原菌进行分离鉴定。同时，配合严密而准确的诊疗方法，才能取得较好的防治效果，才能从根本上控制或减少藏鸡大肠杆菌病的发生，争取把西藏地区藏鸡大肠杆菌病发生率控制在最低限度，最大限度地提高藏区牧民的经济效益，为西藏畜牧业健康快速发展、经济社会跨越式发展奠定基础。
参考文献：
[1] 严昌荣. 浅述藏鸡传染病的诊断与防治[J]. 中国畜禽种业， 2011， 6： 149-150.
[2] 孙朋. 徐州地区蛋鸡大肠杆菌病的诊治[J]. 家畜生态学报， 2011， 32（6）： 77-79.
[3] 郭伶， 代竹青. 一例鸡大肠杆菌的分离与鉴定[J]. 中国畜牧兽医， 2010， 37（1）： 184-185.
[4] 李本科. 鸡大肠杆菌的分离鉴定[J]. 山东畜牧兽医， 2012， 33（1）： 17-18.
作者简介：
刘保光（1983-），男，河南郑州人，硕士研究生，助教，主要从事动物细菌病药物治疗及动物药理学的教学与实验实践研究工作。