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摘要为揭示烟草花叶病毒分子进化特征，从GenBank中下载已报道的烟草花叶病毒全基因组编码区序列，进行重组、系统发育、遗传变异、种群结构和基因漂流等分析。结果表明：突变和负选择作用是驱动烟草花叶病毒进化的主要作用力，种群结构稳定，处于扩张趋势中，基因变异程度低，重组在烟草花叶病毒分子进化中作用不明显。烟草花叶病毒不同分离物形成3个有一定地理相关性的种群ChinaⅠ、China Ⅱ和Europe。欧洲分离物核苷酸序列多样性比中国的差异大，Europe和ChinaⅠ种群可能受到遗传漂变影响，Europe与China Ⅱ、ChinaⅠ与China Ⅱ之间存在发生基因交流的渠道。
关键词
烟草花叶病毒；全基因组编码序列；系统发育；分子进化
中图分类号：
S 435.72
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.05.013
Complete genomic coding sequencebased molecular evolutionary
analysis of Tobacco mosaic virus
Liu Tianbo1，4，Zhou Zhicheng1，Peng Shuguang2，Zeng Wei’ai3，Tang Qianjun4
（1. Tobacco Research Institute of Hunan Province， Changsha410004， China； 2. Tobacco Companyof Hunan， Changsha 410004， China； 3. Tobacco Company of Changsha， Hunan410010， China；4. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Hunan410128， China）
Abstract
To reveal the molecular evolution of Tobacco mosaic virus （TMV）， the complete genomic coding sequences of TMV from GenBank were subjected to molecular evolutionary analysis， including recombination， phylogeny， genetic variation， population structure， gene flow， etc. The results indicated that mutation and negative selection were the main driving forces for TMV evolution， rather than recombination. The TMV populations had stable structure， but were expanding， and the gene mutation was low. Three geographically correlative species of TMV named ChinaⅠ， China Ⅱand Europe were found. The Europe isolates exhibited greater nucleotide diversity than the China ones； Europe and ChinaⅠpopulations could be influenced by genetic drift， and there were gene exchange channels between Europe and China Ⅱ and between ChinaⅠand China Ⅱ.
Key words
Tobacco mosaic virus；complete genomic coding sequence；phylogenetics；molecular evolution
煙草花叶病毒Tobacco mosaic virus （TMV）是烟草花叶病毒属Tobamovirus的代表成员，是危害最严重的病毒之一[1]。由TMV侵染引起的烟草花叶病在全世界烟草栽培地区普遍发生，已成为威胁中国烟叶生产的主要病害之一，且近年来呈日趋严重的趋势[2]。TMV寄主范围广，可侵染30 个科、310 多种植物，地理分布广泛，分布于中国、韩国、西班牙和美国等多个国家[36]。TMV具有较多的株系，目前没有统一的划分标准，主要株系有TMVOM、TMVU1、TMVVulgare、TMVRS、TMVC、TMVN、TMVY[78]。TMV是一种正单链RNA病毒，基因组全长6 395个核苷酸（nucleotide， nt），共编码4 个开放阅读框（open reading frame， ORF），ORF1编码126 kD的蛋白质，其终止密码子（UAG）是渗漏性的（leaky），产生了一个较大的183 kD的通读蛋白ORF2，ORF2的末端5个密码子与编码30 kD蛋白质的ORF3重叠，ORF3终止于ORF4的起始密码子前两个核苷酸的位置，ORF4编码17.6 kD的外壳蛋白[910]。
目前，源于不同国家或地区、不同寄主病毒分离物的基因序列不断被报道，通过生物信息学技术和方法对这些序列加以分析和研究，明确病毒不同分离物的起源、亲缘关系、遗传变异和分子进化，了解全球范围内或地域内病毒的发展动态和趋势，对监测和防控病毒病具有重要意义。但是，这类分析是建立在一定数量的病毒株系（或分离物） 序列基础上，部分病毒由于报道的全序列或编码区序列数量有限，目前还无法全面分析其变异进化规律和株系间亲缘关系特征，另外基于一个或多个基因进行分析，其结果往往带有一定的片面性。贾琳等[11]对猪瘟病毒Classical swine fever virus （CSFV） 基因组全编码区进行了选择压力及重组分析，发现重组改变了重组株所在的进化树分支，影响了CSFV 的遗传多样性，针对宿主免疫系统的选择压力而产生的突变和重组推动了病毒编码区基因的进化。张新珩等[12]对鸡传染性贫血病毒Chicken anemia virus （CAV）全基因组编码区进行变异点和分子进化分析，监测了广东省CAV序列变异情况及流行特点。这类基于基因组全编码区的分子进化分析， 其分析结果更具参考价值。 TMV全基因组序列的报道不断增加，研究多集中在单一序列的结构分析上，如复制酶、移动蛋白 （movement protein， MP）、外壳蛋白（coat protein， CP）序列结构分析[1315]等。但对来自不同国家或地区、不同寄主上的TMV株系或分离物，其起源、变异或重组、种群结构、进化机制等方面研究却鲜有报道。本研究以目前已报道的TMV 全基因组编码区序列为研究对象，进行重组、系统发育、遗传变异、基因交流和种群结构分析，揭示TMV分子变异进化特征，为TMV的抗病育种和防治提供理论指导。
1材料与方法
1.1材料
从 NCBI 上下载目前已报道的所有的TMV 分离物全基因组序列（截至2016年10月31日），共获得72条TMV分离物全基因序列，并选取2株近缘物种番茄花叶病毒Tomato mosaic virus（ToMV）分离物作为外群。
1.2方法
1.2.1序列数据处理
用BioEdit[16]对所有的数据进行修正处理，去掉序列中存在的瑕疵并删除终止密码子。将整理后的序列用ClustralX2[17]比对，这种比对产生的结果可能存在部分 gap 不是 3 的倍数，因此将核苷酸序列数据对应的氨基酸序列再用 TransAlign[18]软件比对，以保证经过序列比对后得到的核苷酸序列能够正确地编译出氨基酸序列。TMV的分离物ORF3和ORF4之间一般存在基因间隔区，经过上述一系列的序列处理后，去掉基因间隔区，然后将所有的ORF组装在一起进行后续的分析。
1.2.2重组分析
利用RDP4.0[19]软件包中的 RDP、Geneconv、Bootscan、Maxchi、Chimaera、3Seq和 Siscan检测可能存在的重组位点，利用SimPlot软件进行检测验证重组位点存在的可能性。当某分离物出现4个软件的检测结果都是 P<1.0×10-6时，则该分离物有可能的重组，否则没有重组或不存在潜在重组[20]。使用软件时采用系统默认值，设定置信值（Pvalue）为0.01。
1.2.3系统发育分析
采用MEGA 5.0中的Clustral W[21]软件进行序列比对，利用最大似然法（maximum likelihood， ML）构建系统进化树，重复1 000次。在 ML 法分析中，数据最适的核苷酸替代模型用 jModelTest 0.1.1 软件[22]计算，结果显示TRG I G为最适的核苷酸替代模型；在 ML分析中采用自举法，进行1 000倍模拟复制计算支长。
1.2.4遗传差异以及基因交流
种群之间的遗传差异由 DnaSP 5.0[23]软件计算，统计Ks，Z和Snn三个参数衡量[2425]。如果Ks和Z统计值很小，P<0.05，则认为存在遗传差异。基因交流用Fst和Nm值来衡量，Fst的绝对值小于0.33，说明两个种群之间存在基因交流，反之，交流不频繁[2627]。若Nm<1，则说明在种群间很容易发生基因漂变，是群体发生遗传差异的主要原因；若Nm>1则说明种群间存在可以发生基因交流的渠道或者地緣关系较近。
1.2.5选择压力分析
将分离物按寄主和地理来源分为不同的组，应用 MEGA5.0 软件中PamiloBianchiLi法分别计算非同义和同义突变之间的比值（dN/dS）[28]。若dN/dS=1则说明该组分离物存在中性选择；若dN/dS<1则说明该组分离物存在负选择或净化；若dN/dS>1 则说明该组分离物存在正向选择或多样化选择。
1.2.6突变位点和保守区域分析
利用DnaSP 5.0软件，对TMV编码区基因序列5 937个位点进行突变位点和保守区域分析。
1.2.7种群结构分析
不同种群分离物的核苷酸多样性与单体型多样性采用 DnaSP 5.0软件计算。基于Tajima’s D和Fu
关键词
烟草花叶病毒；全基因组编码序列；系统发育；分子进化
中图分类号：
S 435.72
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.05.013
Complete genomic coding sequencebased molecular evolutionary
analysis of Tobacco mosaic virus
Liu Tianbo1，4，Zhou Zhicheng1，Peng Shuguang2，Zeng Wei’ai3，Tang Qianjun4
（1. Tobacco Research Institute of Hunan Province， Changsha410004， China； 2. Tobacco Companyof Hunan， Changsha 410004， China； 3. Tobacco Company of Changsha， Hunan410010， China；4. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Hunan410128， China）
Abstract
To reveal the molecular evolution of Tobacco mosaic virus （TMV）， the complete genomic coding sequences of TMV from GenBank were subjected to molecular evolutionary analysis， including recombination， phylogeny， genetic variation， population structure， gene flow， etc. The results indicated that mutation and negative selection were the main driving forces for TMV evolution， rather than recombination. The TMV populations had stable structure， but were expanding， and the gene mutation was low. Three geographically correlative species of TMV named ChinaⅠ， China Ⅱand Europe were found. The Europe isolates exhibited greater nucleotide diversity than the China ones； Europe and ChinaⅠpopulations could be influenced by genetic drift， and there were gene exchange channels between Europe and China Ⅱ and between ChinaⅠand China Ⅱ.
Key words
Tobacco mosaic virus；complete genomic coding sequence；phylogenetics；molecular evolution
煙草花叶病毒Tobacco mosaic virus （TMV）是烟草花叶病毒属Tobamovirus的代表成员，是危害最严重的病毒之一[1]。由TMV侵染引起的烟草花叶病在全世界烟草栽培地区普遍发生，已成为威胁中国烟叶生产的主要病害之一，且近年来呈日趋严重的趋势[2]。TMV寄主范围广，可侵染30 个科、310 多种植物，地理分布广泛，分布于中国、韩国、西班牙和美国等多个国家[36]。TMV具有较多的株系，目前没有统一的划分标准，主要株系有TMVOM、TMVU1、TMVVulgare、TMVRS、TMVC、TMVN、TMVY[78]。TMV是一种正单链RNA病毒，基因组全长6 395个核苷酸（nucleotide， nt），共编码4 个开放阅读框（open reading frame， ORF），ORF1编码126 kD的蛋白质，其终止密码子（UAG）是渗漏性的（leaky），产生了一个较大的183 kD的通读蛋白ORF2，ORF2的末端5个密码子与编码30 kD蛋白质的ORF3重叠，ORF3终止于ORF4的起始密码子前两个核苷酸的位置，ORF4编码17.6 kD的外壳蛋白[910]。
目前，源于不同国家或地区、不同寄主病毒分离物的基因序列不断被报道，通过生物信息学技术和方法对这些序列加以分析和研究，明确病毒不同分离物的起源、亲缘关系、遗传变异和分子进化，了解全球范围内或地域内病毒的发展动态和趋势，对监测和防控病毒病具有重要意义。但是，这类分析是建立在一定数量的病毒株系（或分离物） 序列基础上，部分病毒由于报道的全序列或编码区序列数量有限，目前还无法全面分析其变异进化规律和株系间亲缘关系特征，另外基于一个或多个基因进行分析，其结果往往带有一定的片面性。贾琳等[11]对猪瘟病毒Classical swine fever virus （CSFV） 基因组全编码区进行了选择压力及重组分析，发现重组改变了重组株所在的进化树分支，影响了CSFV 的遗传多样性，针对宿主免疫系统的选择压力而产生的突变和重组推动了病毒编码区基因的进化。张新珩等[12]对鸡传染性贫血病毒Chicken anemia virus （CAV）全基因组编码区进行变异点和分子进化分析，监测了广东省CAV序列变异情况及流行特点。这类基于基因组全编码区的分子进化分析， 其分析结果更具参考价值。 TMV全基因组序列的报道不断增加，研究多集中在单一序列的结构分析上，如复制酶、移动蛋白 （movement protein， MP）、外壳蛋白（coat protein， CP）序列结构分析[1315]等。但对来自不同国家或地区、不同寄主上的TMV株系或分离物，其起源、变异或重组、种群结构、进化机制等方面研究却鲜有报道。本研究以目前已报道的TMV 全基因组编码区序列为研究对象，进行重组、系统发育、遗传变异、基因交流和种群结构分析，揭示TMV分子变异进化特征，为TMV的抗病育种和防治提供理论指导。
1材料与方法
1.1材料
从 NCBI 上下载目前已报道的所有的TMV 分离物全基因组序列（截至2016年10月31日），共获得72条TMV分离物全基因序列，并选取2株近缘物种番茄花叶病毒Tomato mosaic virus（ToMV）分离物作为外群。
1.2方法
1.2.1序列数据处理
用BioEdit[16]对所有的数据进行修正处理，去掉序列中存在的瑕疵并删除终止密码子。将整理后的序列用ClustralX2[17]比对，这种比对产生的结果可能存在部分 gap 不是 3 的倍数，因此将核苷酸序列数据对应的氨基酸序列再用 TransAlign[18]软件比对，以保证经过序列比对后得到的核苷酸序列能够正确地编译出氨基酸序列。TMV的分离物ORF3和ORF4之间一般存在基因间隔区，经过上述一系列的序列处理后，去掉基因间隔区，然后将所有的ORF组装在一起进行后续的分析。
1.2.2重组分析
利用RDP4.0[19]软件包中的 RDP、Geneconv、Bootscan、Maxchi、Chimaera、3Seq和 Siscan检测可能存在的重组位点，利用SimPlot软件进行检测验证重组位点存在的可能性。当某分离物出现4个软件的检测结果都是 P<1.0×10-6时，则该分离物有可能的重组，否则没有重组或不存在潜在重组[20]。使用软件时采用系统默认值，设定置信值（Pvalue）为0.01。
1.2.3系统发育分析
采用MEGA 5.0中的Clustral W[21]软件进行序列比对，利用最大似然法（maximum likelihood， ML）构建系统进化树，重复1 000次。在 ML 法分析中，数据最适的核苷酸替代模型用 jModelTest 0.1.1 软件[22]计算，结果显示TRG I G为最适的核苷酸替代模型；在 ML分析中采用自举法，进行1 000倍模拟复制计算支长。
1.2.4遗传差异以及基因交流
种群之间的遗传差异由 DnaSP 5.0[23]软件计算，统计Ks，Z和Snn三个参数衡量[2425]。如果Ks和Z统计值很小，P<0.05，则认为存在遗传差异。基因交流用Fst和Nm值来衡量，Fst的绝对值小于0.33，说明两个种群之间存在基因交流，反之，交流不频繁[2627]。若Nm<1，则说明在种群间很容易发生基因漂变，是群体发生遗传差异的主要原因；若Nm>1则说明种群间存在可以发生基因交流的渠道或者地緣关系较近。
1.2.5选择压力分析
将分离物按寄主和地理来源分为不同的组，应用 MEGA5.0 软件中PamiloBianchiLi法分别计算非同义和同义突变之间的比值（dN/dS）[28]。若dN/dS=1则说明该组分离物存在中性选择；若dN/dS<1则说明该组分离物存在负选择或净化；若dN/dS>1 则说明该组分离物存在正向选择或多样化选择。
1.2.6突变位点和保守区域分析
利用DnaSP 5.0软件，对TMV编码区基因序列5 937个位点进行突变位点和保守区域分析。
1.2.7种群结构分析
不同种群分离物的核苷酸多样性与单体型多样性采用 DnaSP 5.0软件计算。基于Tajima’s D和Fu