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摘 要：本研究利用SCoT12引物对8个不同花生品种扩增产物中的一个长度多态性片段SCoT12-800进行克隆和测序分析，该序列登录号为KM200036。结果表明，该片段多态性是由于其含有一段TC简单重复序列（Simple Sequence Repeat， SSR），根据该片段序列，利用Primer 5.0软件设计出一对适合SSR分子标记检测的引物，命名为SCoT12-SSR，该引物的扩增产物大小为164～178 bp，在花生栽培种中可检测到5个等位变异，可用于花生的遗传多样性、品种鉴定、基因定位和遗传图谱的构建等研究。
关键词：花生；分子标记；SCoT；SSR
中图分类号：S565.2+Q781 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0008-05 花生（Arachis hypogaea L.）又名落花生，是我国重要的经济作物和油料作物之一。栽培花生是包含来自于不同野生品种A和B两个基因组的异源四倍体作物[1]。研究表明，单一杂交多倍化以及在育种过程中高频使用少数骨干亲本，使得品种间的遗传基础趋于狭窄，基因组高度保守，遗传多样性降低[2]。因此，了解栽培花生品种间的遗传多样性，开发有效的遗传多样性标记对于花生育种以及种质鉴定都具有重大意义。
SSR（Simple Sequence Repeat）又称为微卫星DNA，是指由2～6个核苷酸为基本单位多次串联重复所构成的一段DNA序列。SSR标记技术与目前常用的如RFLP、RAPD、STS、SCAR、SPAR、AFLP等标记技术相比， 具有分布均匀、简单快速、稳定性高、重复性好以及多态性丰富等优点，因此在水稻[3]、玉米[4]、小麦[5]等作物研究中得到了广泛应用。花生SSR分子标记的开发相对缓慢，虽然目前已经公布的花生SSR分子标记数达到了15 518，但只有13.5%～14.5%的分子标记在花生栽培种中具有多态性[6，7]，很难满足现今的科研需求。
目标起始密码子多态性（Start Codon Targeted Polymorphism，SCoT）分子标记是由Collard和Mackill[8]开发的一种目标分子标记新技术，该标记依据植物基因中ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计单引物对基因组进行扩增，并对扩增产物进行电泳检测。SCoT分子标记技术产生的标记大部分是显性标记（引物结合位点的点突变），但也会产生像RAPD标记技术一样的由于插入-缺失突变引起的长度多态性共显性标记，其产物片段大小在200～2 000 bp之间。SCoT分子标记作为一种新型的分子标记具有操作简便、可在各物种间通用、能有效产生与性状连锁的标记等特点。目前，该标记技术已在水稻、马铃薯[9]等作物中成功应用，在花生中也有报道[10，11]。但由于该技术采用单引物扩增，使其存在扩增条带过多，特别是一些共显性插入-缺失片段由于差异不明显而造成结果不易分析等缺点。
本研究利用已公布的SCoT分子标记对8个不同的花生品种进行多态性分析，发现其中一个引物SCoT12扩增产物中的一个片段存在长度多态性差异。测序结果表明该片段包含一段TC重复，并利用该序列成功开发出了一个具有多态性的SSR分子标记。
1 材料与方法
1.1 试验材料
8个供试品种，分别为950527、花育22号、DF12、开农176、开17-15、York-1、Q13-2-1、Q13-21-1。所用供试材料均种植于山东省花生研究所试验基地，并在苗期取健康植株上的无病虫害幼嫩叶片，液氮速冻后于-70℃保存。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA提取及PCR反应 基因组DNA提取采用小量CTAB法，并做了相应改良。SCoT-PCR反应体系及反应程序参照熊发前等[12]报道的方法进行优化。优化后的PCR体系总体积为10 μL，含2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]3.75 μL、0.5 μmol/L引物、50 ng基因组DNA。PCR程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35个循环；72℃最后延伸5 min。SSR-PCR反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃最后延伸5 min。SCoT-PCR使用SCoT12引物[11]，SSR-PCR使用根据测序结果开发的SCoT12-SSR引物（引物序列见表1）。
1.2.2 PCR产物电泳检测 SCoT-PCR与SSR-PCR产物分别使用浓度为3.5%的变性聚丙烯酰胺凝胶和6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（电泳缓冲液0.5×TBE，电压150 V，时间2 h），0.1% AgNO3染色，对电泳结果进行拍照。测序片段检测及回收使用1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用GelRed（Biotium，USA）染色，在紫外凝胶成像系统上观察并切下目标条带所在胶块放入2 mL EP管中备用。
1.2.3 PCR产物目的片段回收、连接载体及测序 目的片段的回收、纯化使用琼脂糖凝胶回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]。将回收的目的片段与pMD19-T Vector（Simple）（TaKaRa，大连）连接后，使用热激法转化Top10感受态细胞[天根生化科技（北京）有限公司]，并进行蓝白斑筛选，挑选白色菌斑进行PCR检测，方法参考产品说明书。将检测后阳性克隆菌落接入5 mL含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜。将过夜培养菌液送金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测序及菌落PCR检测均使用M13引物（引物序列见表1）。
1.2.4 测序结果分析 测序结果经DNASTAR软件中SeqMan拼接完整，利用MegAlign比较不同供试材料间该位点的多态性，并通过NCBI BLAST进行相似性检测以及阅读框分析。 2 结果与分析
2.1 SCoT12扩增产物多态性分析
在8个供试品种中，SCoT12引物可扩增出11条清晰、稳定条带（图1），片段大小在300～2 000 bp之间。其中，不同品种在800 bp处均可检测到一条大小有微小差异的片段，将该片段命名为SCoT12-800。
2.2 SCoT12-800阳性克隆检测
使用M13引物对重组载体pMD19-T+SCoT12-800的转化菌株的不同单克隆进行PCR检测（图2），其中有SCoT12-800片段插入的克隆PCR扩增片段长度应为930 bp左右，而有些克隆的扩增片段长度不在上述范围，可能是pMD19-T载体在连接过程中插入了其他片段或是载体发生自连而产生了假阳性。
2.3 测序结果分析
对上述长度多态性片段的测序结果显示该扩增片段长度为808～822 bp，片段内部存在一段TC多次重复构成的SSR序列位点。图3为花生品种DF12的SCoT12-800的核苷酸序列， TC重复单元的次数为32。所选供试品种的测序结果显示该位点存在5种不同的变异类型（图4）。
2.4 序列比对及SSR标记引物设计
为了明确该SSR标记是否为已公布SSR标记，将上述测序结果进行BLAST序列比对分析。结果显示该序列是一个新发现的花生SSR序列，GenBank登录号为KM200036。根据该片段序列
利用Primer 5.0软件设计出一对适合SSR分子标记检测的引物，命名为SCoT12-SSR（表1）。其正向引物长度20 bp，GC含量50%，Tm值60℃；反向引物长度20 bp，GC含量55%，Tm值62℃。电泳检测结果显示该位点存在164、168、172、174、178 bp 5个等位变异（图5），电泳检测结果与测序结果吻合。
3 结论与讨论
SCoT分子标记是根据基因起始密码子（ATG）两端保守区域设计的单引物扩增片段，其扩增产物由于不同品种间启动子两端碱基变化以及碱基插入-缺失引起的变化而表现出一定的多态性[6]。此外，因为起始密码子（ATG）是功能基因的一个组成部分，所以SCoT标记技术所产生的标记很有可能与决定不同品种特性的功能基因相关联[12]。本研究对SCoT12-800片段进行阅读框分析，并未发现包含具有编码功能的阅读框，说明该标记片段与决定品种间差异特性的功能基因不关联。但由于SCoT分子标记广泛分布在整个基因组上，利用本研究方法对其他多态性标记进行序列分析，有可能检测到一些与品种特性相关的功能基因。
另外，由于SCoT分子标记扩增片段大小在200～2 000 bp之间[13]，而其长度多态性差异通常在几个碱基至几十个碱基之间，利用现有SCoT检测方法（1.5%琼脂糖凝胶电泳或3.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）无法精确区分该标记，因此通过对SCoT长度多态性标记片段进行测序分析，可以清楚地了解该片段的序列，并开发出更方便、精确的分子标记。本研究通过对SCoT12分子标记中的一个长度多态性片段进行测序分析，开发出了一个新的SCoT12-SSR分子标记，该SSR标记可以准确区分此位点上的5个不同的等位变异。因此，利用该方法开发新的多态性标记是对现有花生多态性分子标记的补充。
参 考 文 献：
[1] Kochert G， Stalker H T， Gimenes M， et al. RFLP and cytogenetic evidence on the origin and evolution of allotetraploid domesticated peanut， Arachis hypogaea （Leguminosae）[J]. Am. J. Bot.， 1996， 83： 1282-1291.
[2] Kochert G， Halward T， Branch W D， et al. RFLP variability in peanut （Arachis hypogaea L.） cultivars and wild species[J]. Theor. Appl. Genet.， 1991， 81： 565-570.
[3] McCouch S R， Teytelman L， Xu Y， et al. Development and mapping of 2240 new SSR marker for rice （Oryza sativa L.）[J]. DNA Res.， 2002， 9（6）： 199-207.
[4] Sharopova N， McMullen M D， Linda S， et al. Development and mapping of SSR markers for maize[J]. Plant Mol. Bio.， 2002， 48（5/6）： 463-481.
[5] Rder M S， Korzun V， Wendehake K， et al. A microsatellite map of wheat[J]. Genetics， 1998， 149（4）： 2007-2023.
[6] Zhao Y， Prakash C S， He G. Characterization and compilation of polymorphic simple sequence repeat （SSR） markers of peanut from public database[J]. BMC Res. Notes， 2012， 5： 362.
[7] Guo B， Pandey M K， He G， et al. Recent advances in molecular genetic linkage maps of cultivated peanut[J]. Peanut Science， 2013， 40（2）： 95-106. [8] Collard B C Y， Mackill D J. Start codon targeted （SCoT） polymorphism： a simple， novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants[J]. Plant Mol. Biol. Rep.， 2009， 27： 86-93.
[9] Gorji A M， Poczai P， Polgar Z， et al. Efficiency of arbitrarily amplified dominant markers （SCoT， ISSR and RAPD） for diagnostic fingerprinting in tetraploid potato[J]. Am. J. Pot. Res.， 2011， 88： 226-237.
[10] Xiong F， Zhou R， Han Z， et al. Start condon targeted polymorphism for evaluation of functional genetic variation and relationships in cultivated peanut （Arachis hypogaea L.） genotypes[J]. Mol. Biol. Rep.， 2011， 38： 3487-3494.
[11] 贺梁琼， 熊发前， 钟瑞春， 等. 利用SCoT标记分析花生栽培种×A. chacoensis组合异源多倍化的早期基因组变化[J]. 中国农业科学， 2013， 46（8）： 1555-1563.
[12] 熊发前， 唐荣华， 陈忠良， 等. 目标起始密码子多态性（SCoT）： 一种基于翻译起始位点的目的基因标记新技术[J]. 分子植物育种， 2009， 7（3）： 635-638.
[13] 熊发前， 蒋菁， 钟瑞春， 等. 目标起始密码子多态性（SCoT）分子标记技术在花生属中的应用[J]. 作物学报， 2010， 36（10）： 2055-2061. 山 东 农 业 科 学 2014，46（11）：15～17
关键词：花生；分子标记；SCoT；SSR
中图分类号：S565.2+Q781 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0008-05 花生（Arachis hypogaea L.）又名落花生，是我国重要的经济作物和油料作物之一。栽培花生是包含来自于不同野生品种A和B两个基因组的异源四倍体作物[1]。研究表明，单一杂交多倍化以及在育种过程中高频使用少数骨干亲本，使得品种间的遗传基础趋于狭窄，基因组高度保守，遗传多样性降低[2]。因此，了解栽培花生品种间的遗传多样性，开发有效的遗传多样性标记对于花生育种以及种质鉴定都具有重大意义。
SSR（Simple Sequence Repeat）又称为微卫星DNA，是指由2～6个核苷酸为基本单位多次串联重复所构成的一段DNA序列。SSR标记技术与目前常用的如RFLP、RAPD、STS、SCAR、SPAR、AFLP等标记技术相比， 具有分布均匀、简单快速、稳定性高、重复性好以及多态性丰富等优点，因此在水稻[3]、玉米[4]、小麦[5]等作物研究中得到了广泛应用。花生SSR分子标记的开发相对缓慢，虽然目前已经公布的花生SSR分子标记数达到了15 518，但只有13.5%～14.5%的分子标记在花生栽培种中具有多态性[6，7]，很难满足现今的科研需求。
目标起始密码子多态性（Start Codon Targeted Polymorphism，SCoT）分子标记是由Collard和Mackill[8]开发的一种目标分子标记新技术，该标记依据植物基因中ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计单引物对基因组进行扩增，并对扩增产物进行电泳检测。SCoT分子标记技术产生的标记大部分是显性标记（引物结合位点的点突变），但也会产生像RAPD标记技术一样的由于插入-缺失突变引起的长度多态性共显性标记，其产物片段大小在200～2 000 bp之间。SCoT分子标记作为一种新型的分子标记具有操作简便、可在各物种间通用、能有效产生与性状连锁的标记等特点。目前，该标记技术已在水稻、马铃薯[9]等作物中成功应用，在花生中也有报道[10，11]。但由于该技术采用单引物扩增，使其存在扩增条带过多，特别是一些共显性插入-缺失片段由于差异不明显而造成结果不易分析等缺点。
本研究利用已公布的SCoT分子标记对8个不同的花生品种进行多态性分析，发现其中一个引物SCoT12扩增产物中的一个片段存在长度多态性差异。测序结果表明该片段包含一段TC重复，并利用该序列成功开发出了一个具有多态性的SSR分子标记。
1 材料与方法
1.1 试验材料
8个供试品种，分别为950527、花育22号、DF12、开农176、开17-15、York-1、Q13-2-1、Q13-21-1。所用供试材料均种植于山东省花生研究所试验基地，并在苗期取健康植株上的无病虫害幼嫩叶片，液氮速冻后于-70℃保存。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA提取及PCR反应 基因组DNA提取采用小量CTAB法，并做了相应改良。SCoT-PCR反应体系及反应程序参照熊发前等[12]报道的方法进行优化。优化后的PCR体系总体积为10 μL，含2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]3.75 μL、0.5 μmol/L引物、50 ng基因组DNA。PCR程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35个循环；72℃最后延伸5 min。SSR-PCR反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃最后延伸5 min。SCoT-PCR使用SCoT12引物[11]，SSR-PCR使用根据测序结果开发的SCoT12-SSR引物（引物序列见表1）。
1.2.2 PCR产物电泳检测 SCoT-PCR与SSR-PCR产物分别使用浓度为3.5%的变性聚丙烯酰胺凝胶和6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（电泳缓冲液0.5×TBE，电压150 V，时间2 h），0.1% AgNO3染色，对电泳结果进行拍照。测序片段检测及回收使用1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用GelRed（Biotium，USA）染色，在紫外凝胶成像系统上观察并切下目标条带所在胶块放入2 mL EP管中备用。
1.2.3 PCR产物目的片段回收、连接载体及测序 目的片段的回收、纯化使用琼脂糖凝胶回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]。将回收的目的片段与pMD19-T Vector（Simple）（TaKaRa，大连）连接后，使用热激法转化Top10感受态细胞[天根生化科技（北京）有限公司]，并进行蓝白斑筛选，挑选白色菌斑进行PCR检测，方法参考产品说明书。将检测后阳性克隆菌落接入5 mL含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜。将过夜培养菌液送金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测序及菌落PCR检测均使用M13引物（引物序列见表1）。
1.2.4 测序结果分析 测序结果经DNASTAR软件中SeqMan拼接完整，利用MegAlign比较不同供试材料间该位点的多态性，并通过NCBI BLAST进行相似性检测以及阅读框分析。 2 结果与分析
2.1 SCoT12扩增产物多态性分析
在8个供试品种中，SCoT12引物可扩增出11条清晰、稳定条带（图1），片段大小在300～2 000 bp之间。其中，不同品种在800 bp处均可检测到一条大小有微小差异的片段，将该片段命名为SCoT12-800。
2.2 SCoT12-800阳性克隆检测
使用M13引物对重组载体pMD19-T+SCoT12-800的转化菌株的不同单克隆进行PCR检测（图2），其中有SCoT12-800片段插入的克隆PCR扩增片段长度应为930 bp左右，而有些克隆的扩增片段长度不在上述范围，可能是pMD19-T载体在连接过程中插入了其他片段或是载体发生自连而产生了假阳性。
2.3 测序结果分析
对上述长度多态性片段的测序结果显示该扩增片段长度为808～822 bp，片段内部存在一段TC多次重复构成的SSR序列位点。图3为花生品种DF12的SCoT12-800的核苷酸序列， TC重复单元的次数为32。所选供试品种的测序结果显示该位点存在5种不同的变异类型（图4）。
2.4 序列比对及SSR标记引物设计
为了明确该SSR标记是否为已公布SSR标记，将上述测序结果进行BLAST序列比对分析。结果显示该序列是一个新发现的花生SSR序列，GenBank登录号为KM200036。根据该片段序列
利用Primer 5.0软件设计出一对适合SSR分子标记检测的引物，命名为SCoT12-SSR（表1）。其正向引物长度20 bp，GC含量50%，Tm值60℃；反向引物长度20 bp，GC含量55%，Tm值62℃。电泳检测结果显示该位点存在164、168、172、174、178 bp 5个等位变异（图5），电泳检测结果与测序结果吻合。
3 结论与讨论
SCoT分子标记是根据基因起始密码子（ATG）两端保守区域设计的单引物扩增片段，其扩增产物由于不同品种间启动子两端碱基变化以及碱基插入-缺失引起的变化而表现出一定的多态性[6]。此外，因为起始密码子（ATG）是功能基因的一个组成部分，所以SCoT标记技术所产生的标记很有可能与决定不同品种特性的功能基因相关联[12]。本研究对SCoT12-800片段进行阅读框分析，并未发现包含具有编码功能的阅读框，说明该标记片段与决定品种间差异特性的功能基因不关联。但由于SCoT分子标记广泛分布在整个基因组上，利用本研究方法对其他多态性标记进行序列分析，有可能检测到一些与品种特性相关的功能基因。
另外，由于SCoT分子标记扩增片段大小在200～2 000 bp之间[13]，而其长度多态性差异通常在几个碱基至几十个碱基之间，利用现有SCoT检测方法（1.5%琼脂糖凝胶电泳或3.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）无法精确区分该标记，因此通过对SCoT长度多态性标记片段进行测序分析，可以清楚地了解该片段的序列，并开发出更方便、精确的分子标记。本研究通过对SCoT12分子标记中的一个长度多态性片段进行测序分析，开发出了一个新的SCoT12-SSR分子标记，该SSR标记可以准确区分此位点上的5个不同的等位变异。因此，利用该方法开发新的多态性标记是对现有花生多态性分子标记的补充。
参 考 文 献：
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[6] Zhao Y， Prakash C S， He G. Characterization and compilation of polymorphic simple sequence repeat （SSR） markers of peanut from public database[J]. BMC Res. Notes， 2012， 5： 362.
[7] Guo B， Pandey M K， He G， et al. Recent advances in molecular genetic linkage maps of cultivated peanut[J]. Peanut Science， 2013， 40（2）： 95-106. [8] Collard B C Y， Mackill D J. Start codon targeted （SCoT） polymorphism： a simple， novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants[J]. Plant Mol. Biol. Rep.， 2009， 27： 86-93.
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[11] 贺梁琼， 熊发前， 钟瑞春， 等. 利用SCoT标记分析花生栽培种×A. chacoensis组合异源多倍化的早期基因组变化[J]. 中国农业科学， 2013， 46（8）： 1555-1563.
[12] 熊发前， 唐荣华， 陈忠良， 等. 目标起始密码子多态性（SCoT）： 一种基于翻译起始位点的目的基因标记新技术[J]. 分子植物育种， 2009， 7（3）： 635-638.
[13] 熊发前， 蒋菁， 钟瑞春， 等. 目标起始密码子多态性（SCoT）分子标记技术在花生属中的应用[J]. 作物学报， 2010， 36（10）： 2055-2061. 山 东 农 业 科 学 2014，46（11）：15～17