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【摘 要】 目的：建立石淋通颗粒HPLC指纹图谱 并进行分析。方法：Agilent zorbax SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm 5 μm）;乙腈-0.4%磷酸水为流动相进行等度洗脱;检测波长335 nm;柱温30 ℃。测定20批石淋通颗粒的指纹图谱 运用相似度评价系统、SPSS 22.0软件进行分析。结果：构建了由10个共有峰组成的石淋通颗粒HPLC指纹图谱 指认了夏佛塔苷、异夏佛塔苷、新西兰牡荆苷2三成分 20批次石淋通颗粒的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均在0.990以上。 结论：所建立的指纹图谱专属性强 重现性好 能够为该制剂的质量评价提供依据。
【关键词】 石淋通颗粒;指纹图谱;夏佛塔苷
Abstract：Objective The HPLC fingerprint of Shilongtong granules was established and analyzed. Methods Agilent zorbax SB-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）; Acetonitrile-0.4% phosphoric acid water was eluted equally in mobile phase; Detection wavelength： 335nm; Column temperature： 30 ℃. The fingerprints of 20 batches of Shilintong granules were measured and analyzed by using the similarity evaluation system and SPSS 22.0 software. Results The HPLC fingerprint of Shilintong granules composed of 10 characteristic peaks was constructed， and the three components of Xiafutarin， Isafutarin and New Zealand vitex 2 were identified， The similarity between fingerprints of 20 batches of Shilongtong granules and control fingerprints was above 0.990. Conclusion The established fingerprint has strong specificity and good reproducibility， which can provide the basis for the quality evaluation of this preparation.
Keywords：Shilintong Granules; Fingerprint; Schaftoside
石淋通颗粒为广金钱草经提取加工制成 具有清湿热、利尿、排石的作用 用于尿路结石、肾盂肾炎、胆囊炎[1]。现行标准为《卫生部药品标准》中药成方制剂第八册及国家药品标准WS3-B-1520-93-1、WS3-B-1520-93-2 、WS3-B-1520-93-3、WS-11044（ZD-1044）-2002-2011Z、国家药品标准修订批件2000ZFB 0058所附石淋通颗粒质量标准等5个注册标准 检验项目较少 无法全面评价其质量。而有关文献仅对广金钱草进行夏佛塔苷、总黄酮的含量测定[2-3]。中药制剂的成分复杂 在质量控制中采用单一或几个成分难以控制其整体质量[4-6]。故本实验建立HPLC指纹图谱 并确定其中几个共有峰的成分 从整体上控制该制剂的整体质量。
1 仪器与试药
Waters e2695高效液相色谱仪;AE200 型电子分析天平（德国梅特勒公司）;KQ-300TZ型超声波清洗器（300W 30KHZ）;UV-TOC/UF型超纯水系统（赛默飞）。 石淋通颗粒来自20家不同医药公司生产的20批次样品 编号S1-S20 批号：171004、171003、170902、17070008、171002、17110032、1710006、1709009、170301、20170601、1710020、170502、171001、170902、20171110、667001、1709261、20170201、171201、170801）;广金钱草（批号：121248-201104） 、夏佛塔苷（批号：111912-201703）均购自中国食品药品检定研究院;新西兰牡荆苷2（批号：B21399）、异夏佛塔苷（批号：B21563）均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯;水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Agilent zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸水（B） 等度洗脱;流速：1.0 mL/min;检测波长：335 nm;柱温：30 ℃;进样量：10 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 分别取新西兰牡荆苷2、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品适量 精密称定 加80%甲醇制成浓度分别为13.52 μg/mL、33.04 μg/mL、26.02 μg/mL的溶液 作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液 取本品适量（相当于广金钱草2 g） 研细 精密称定 置具塞锥形瓶中 精密加80%甲醇25 mL 称定重量 超声处理30 min 放冷 再称定重量 用80%甲醇补足减失的重量 摇匀 滤过 取续滤液 即得。
2.3 方法学考察 2.3.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL 在 “2. 1”项色谱条件下连续测定6次 记录色谱图 以夏佛塔苷峰为参照峰 计算其他特征峰的相对保留时间 结果均小于1.0% 说明仪器精密度良好。
2.3.2 重复性试验 取同一批石淋通颗粒 按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液 各精密吸取10 μL 在“2.1”项色谱条件下进样6次测定 记录色谱图 以夏佛塔苷为参照峰 计算其他特征峰的相对保留时间 结果均小于1.0% 说明该方法重复性良好。
2.3.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL 在 “2.1”项色谱条件下于配制后的0、4、8、12、20、24 h进样测定 记录色谱图 以夏佛塔苷为参照峰 计算其他特征峰的相对保留时间 结果均小于2.0% 说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.4 指纹图谱的建立与分析
2.4.1 石淋通颗粒指纹图谱的建立与相似度评价 取20批石林通颗粒 依“2.2.2” 项方法制备供试品溶液并进样测定 记录图谱 标记为S1～S20。20批样品共标出10个共有峰 经与对照品比对 指认3个特征峰 分别为新西兰牡荆苷2（3号峰）、夏佛塔苷（7号峰）、异夏佛塔苷（10号峰） 以7号峰作为参照峰（S） 计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积 见图1、表1、表2。
将相关数据导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版） 以S1（171004）样品为参照 经过多点校正和数据匹配后 平均值法生成对照指纹图谱R 与对照指纹图谱比较20批石淋通颗粒的相似度数据 相似度均大于0.990 说明石淋通颗粒的质量稳定 见表3。
2.4.2 石淋通颗粒指纹图谱的聚类分析 以所得20批样品指纹图谱的10个共有峰的峰面积为变量 导入SPSS 22.0软件 选用平均组间连接聚类方法 以平方欧式距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析 结果如图2所示。当分类距离为20时 20批次石淋通颗粒可以分为2大类 S4、S12、S13、S17、S19号样品聚为一类;其余样品聚为一类。
3 讨论
3.1 供试品溶液制备方法选择 分别比较甲醇、80%甲醇、50%甲醇的提取效果。结果表明 80%甲醇的提取溶液中的色谱峰较其他2种提取溶液中的色谱峰更为丰富 因此选择80%甲醇为提取溶剂。同时参考广金钱草在《2015版中国药典一部》的含量测定方法 采用超声震荡的提取方法。
3.2 检测波长的选择 使用PDA检测器对样品进行210～400 nm的全波长扫描 并对各波长下的色谱图进行分析比较。结果表明 在335 nm下检测到峰的数目较多 各峰分离良好 特征峰明显且峰形较好 从图谱中可以尽可能的获取色谱组分信息以反映体系组成的全貌 因此选定335 nm为检测波长。
3.3 流动相的选择 由于石淋通颗粒化学成分简单 剂型范围小 故选择等度洗脱。在流动相的筛选中 考察了乙腈-0.4%磷酸水系统、甲醇-0.4%磷酸水系统。结果显示 乙腈-0.4%磷酸水系统的基线更稳定 色谱峰个数较多 且拥有较好的分离度 因此选择乙腈-0.4%磷酸水系统为HPLC分析的流动相系统。
3.4 色谱柱的选择 考察3种不同型号色谱柱：Ecosil C18 （250 mm×4.6 mm×5 μm）、Agilent zorbax SB-C18 （250 mm×4.6 mm×5 μm）、Apollo C18（250 mm×4.6 mm×5 μm） 结果表明Agilent zorbax SB-C18 （250 mm×4.6 mm×5 μm）柱分离出的色谱峰分离度好 峰数多 稳定性好 故选择Agilent zorbax SB-C18柱为分析色谱柱。
3.5 参照峰的选择 广金钱草标准收录于《中国药典》（2015年版一部） 其含量测定项目的指标成分为夏佛塔苷。石淋通颗粒为广金钱草的单方制剂 本研究建立的指纹图谱10个特征峰中夏佛塔苷的峰面积最大、峰形好 与广金钱草的指标成分一致 最后选择夏佛塔苷为参照峰（S峰）。在下一阶段研究中 可以参考广金钱草中夏佛塔苷的含量 对本制剂中的夏佛塔苷进行定量研究。
4 结论
本研究运用HPLC法建立了石淋通颗粒的指纹图谱 基本反映了该品种的化学成分全貌 为全面控制石淋通颗粒的质量提供一个新方法。通过对指纹图谱的分析 确定了10个特征峰 以夏佛塔苷的峰为参照峰（S峰） 计算各特征峰与S峰的相对保留时间 其相对保留时间应在规定值的±5%以内。具体规定值为：0.41（峰1）、0.57（峰2）、0.61（峰3）、0.65（峰4）、0.70（峰5）、0.862（峰6）、1.000（峰7，S）、1.237（峰8）、1.289（峰9）、1.455（峰10）。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第8册[M].北京：中华人民共和国卫生部药典委员会，1996：51.
[2]黃劲通.HPLC法测定石淋通颗粒中夏佛塔苷的含量[J].中国医药指南 2012 10（36）：445-446.
[3]赵志军，葛智鑫.石淋通颗粒质量标准的研究[J].中国现代应用学 2006，23.（8）：783-785.
[4]黄晓燕 罗疆南 李瑞莲，等.银柴颗粒特征图谱研究[J].中国药师 2019，22（9）：1610-1612.
[5]戴锦娜，陈晓辉.防风药材HPLC指纹图谱的研究[J].辽宁中医药大学学报 2012，14（12）：185-187.
[6]黄晓燕 王银红 罗疆南，等.金鸡胶囊特征图谱研究[J].中医药导报 2019，25（5）：78-81.
（收稿日期：2020-09-08 编辑：陶希睿）
【关键词】 石淋通颗粒;指纹图谱;夏佛塔苷
Abstract：Objective The HPLC fingerprint of Shilongtong granules was established and analyzed. Methods Agilent zorbax SB-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）; Acetonitrile-0.4% phosphoric acid water was eluted equally in mobile phase; Detection wavelength： 335nm; Column temperature： 30 ℃. The fingerprints of 20 batches of Shilintong granules were measured and analyzed by using the similarity evaluation system and SPSS 22.0 software. Results The HPLC fingerprint of Shilintong granules composed of 10 characteristic peaks was constructed， and the three components of Xiafutarin， Isafutarin and New Zealand vitex 2 were identified， The similarity between fingerprints of 20 batches of Shilongtong granules and control fingerprints was above 0.990. Conclusion The established fingerprint has strong specificity and good reproducibility， which can provide the basis for the quality evaluation of this preparation.
Keywords：Shilintong Granules; Fingerprint; Schaftoside
石淋通颗粒为广金钱草经提取加工制成 具有清湿热、利尿、排石的作用 用于尿路结石、肾盂肾炎、胆囊炎[1]。现行标准为《卫生部药品标准》中药成方制剂第八册及国家药品标准WS3-B-1520-93-1、WS3-B-1520-93-2 、WS3-B-1520-93-3、WS-11044（ZD-1044）-2002-2011Z、国家药品标准修订批件2000ZFB 0058所附石淋通颗粒质量标准等5个注册标准 检验项目较少 无法全面评价其质量。而有关文献仅对广金钱草进行夏佛塔苷、总黄酮的含量测定[2-3]。中药制剂的成分复杂 在质量控制中采用单一或几个成分难以控制其整体质量[4-6]。故本实验建立HPLC指纹图谱 并确定其中几个共有峰的成分 从整体上控制该制剂的整体质量。
1 仪器与试药
Waters e2695高效液相色谱仪;AE200 型电子分析天平（德国梅特勒公司）;KQ-300TZ型超声波清洗器（300W 30KHZ）;UV-TOC/UF型超纯水系统（赛默飞）。 石淋通颗粒来自20家不同医药公司生产的20批次样品 编号S1-S20 批号：171004、171003、170902、17070008、171002、17110032、1710006、1709009、170301、20170601、1710020、170502、171001、170902、20171110、667001、1709261、20170201、171201、170801）;广金钱草（批号：121248-201104） 、夏佛塔苷（批号：111912-201703）均购自中国食品药品检定研究院;新西兰牡荆苷2（批号：B21399）、异夏佛塔苷（批号：B21563）均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯;水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Agilent zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸水（B） 等度洗脱;流速：1.0 mL/min;检测波长：335 nm;柱温：30 ℃;进样量：10 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 分别取新西兰牡荆苷2、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品适量 精密称定 加80%甲醇制成浓度分别为13.52 μg/mL、33.04 μg/mL、26.02 μg/mL的溶液 作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液 取本品适量（相当于广金钱草2 g） 研细 精密称定 置具塞锥形瓶中 精密加80%甲醇25 mL 称定重量 超声处理30 min 放冷 再称定重量 用80%甲醇补足减失的重量 摇匀 滤过 取续滤液 即得。
2.3 方法学考察 2.3.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL 在 “2. 1”项色谱条件下连续测定6次 记录色谱图 以夏佛塔苷峰为参照峰 计算其他特征峰的相对保留时间 结果均小于1.0% 说明仪器精密度良好。
2.3.2 重复性试验 取同一批石淋通颗粒 按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液 各精密吸取10 μL 在“2.1”项色谱条件下进样6次测定 记录色谱图 以夏佛塔苷为参照峰 计算其他特征峰的相对保留时间 结果均小于1.0% 说明该方法重复性良好。
2.3.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL 在 “2.1”项色谱条件下于配制后的0、4、8、12、20、24 h进样测定 记录色谱图 以夏佛塔苷为参照峰 计算其他特征峰的相对保留时间 结果均小于2.0% 说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.4 指纹图谱的建立与分析
2.4.1 石淋通颗粒指纹图谱的建立与相似度评价 取20批石林通颗粒 依“2.2.2” 项方法制备供试品溶液并进样测定 记录图谱 标记为S1～S20。20批样品共标出10个共有峰 经与对照品比对 指认3个特征峰 分别为新西兰牡荆苷2（3号峰）、夏佛塔苷（7号峰）、异夏佛塔苷（10号峰） 以7号峰作为参照峰（S） 计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积 见图1、表1、表2。
将相关数据导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版） 以S1（171004）样品为参照 经过多点校正和数据匹配后 平均值法生成对照指纹图谱R 与对照指纹图谱比较20批石淋通颗粒的相似度数据 相似度均大于0.990 说明石淋通颗粒的质量稳定 见表3。
2.4.2 石淋通颗粒指纹图谱的聚类分析 以所得20批样品指纹图谱的10个共有峰的峰面积为变量 导入SPSS 22.0软件 选用平均组间连接聚类方法 以平方欧式距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析 结果如图2所示。当分类距离为20时 20批次石淋通颗粒可以分为2大类 S4、S12、S13、S17、S19号样品聚为一类;其余样品聚为一类。
3 讨论
3.1 供试品溶液制备方法选择 分别比较甲醇、80%甲醇、50%甲醇的提取效果。结果表明 80%甲醇的提取溶液中的色谱峰较其他2种提取溶液中的色谱峰更为丰富 因此选择80%甲醇为提取溶剂。同时参考广金钱草在《2015版中国药典一部》的含量测定方法 采用超声震荡的提取方法。
3.2 检测波长的选择 使用PDA检测器对样品进行210～400 nm的全波长扫描 并对各波长下的色谱图进行分析比较。结果表明 在335 nm下检测到峰的数目较多 各峰分离良好 特征峰明显且峰形较好 从图谱中可以尽可能的获取色谱组分信息以反映体系组成的全貌 因此选定335 nm为检测波长。
3.3 流动相的选择 由于石淋通颗粒化学成分简单 剂型范围小 故选择等度洗脱。在流动相的筛选中 考察了乙腈-0.4%磷酸水系统、甲醇-0.4%磷酸水系统。结果显示 乙腈-0.4%磷酸水系统的基线更稳定 色谱峰个数较多 且拥有较好的分离度 因此选择乙腈-0.4%磷酸水系统为HPLC分析的流动相系统。
3.4 色谱柱的选择 考察3种不同型号色谱柱：Ecosil C18 （250 mm×4.6 mm×5 μm）、Agilent zorbax SB-C18 （250 mm×4.6 mm×5 μm）、Apollo C18（250 mm×4.6 mm×5 μm） 结果表明Agilent zorbax SB-C18 （250 mm×4.6 mm×5 μm）柱分离出的色谱峰分离度好 峰数多 稳定性好 故选择Agilent zorbax SB-C18柱为分析色谱柱。
3.5 参照峰的选择 广金钱草标准收录于《中国药典》（2015年版一部） 其含量测定项目的指标成分为夏佛塔苷。石淋通颗粒为广金钱草的单方制剂 本研究建立的指纹图谱10个特征峰中夏佛塔苷的峰面积最大、峰形好 与广金钱草的指标成分一致 最后选择夏佛塔苷为参照峰（S峰）。在下一阶段研究中 可以参考广金钱草中夏佛塔苷的含量 对本制剂中的夏佛塔苷进行定量研究。
4 结论
本研究运用HPLC法建立了石淋通颗粒的指纹图谱 基本反映了该品种的化学成分全貌 为全面控制石淋通颗粒的质量提供一个新方法。通过对指纹图谱的分析 确定了10个特征峰 以夏佛塔苷的峰为参照峰（S峰） 计算各特征峰与S峰的相对保留时间 其相对保留时间应在规定值的±5%以内。具体规定值为：0.41（峰1）、0.57（峰2）、0.61（峰3）、0.65（峰4）、0.70（峰5）、0.862（峰6）、1.000（峰7，S）、1.237（峰8）、1.289（峰9）、1.455（峰10）。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第8册[M].北京：中华人民共和国卫生部药典委员会，1996：51.
[2]黃劲通.HPLC法测定石淋通颗粒中夏佛塔苷的含量[J].中国医药指南 2012 10（36）：445-446.
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[4]黄晓燕 罗疆南 李瑞莲，等.银柴颗粒特征图谱研究[J].中国药师 2019，22（9）：1610-1612.
[5]戴锦娜，陈晓辉.防风药材HPLC指纹图谱的研究[J].辽宁中医药大学学报 2012，14（12）：185-187.
[6]黄晓燕 王银红 罗疆南，等.金鸡胶囊特征图谱研究[J].中医药导报 2019，25（5）：78-81.
（收稿日期：2020-09-08 编辑：陶希睿）