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目的
运用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9基因编辑技术构建敲除趋化因子受体4(CXCR4)基因的人脑胶质瘤U251细胞。
方法设计3对针对目标基因CXCR4的导向RNA(sgRNA)，通过PX335质粒构建3组该基因的Cas9表达载体(CXCR4-sgRNA-1、CXCR4-sgRNA-2、CXCR4-sgRNA-3)，测序验证后，将构建正确的载体CXCR4-sgRNA-1转染进至U251细胞，T7核酸内切酶Ⅰ(T7E1)酶切鉴定敲除效率，分离单克隆细胞5组进行培养，分别测序及蛋白印迹法鉴定其敲除效率和蛋白含量，获得稳定敲除阳性单克隆细胞。
结果测序验证CXCR4-sgRNA-1组载体构建成功，转染载体后U251细胞经聚合酶联反应(PCR)酶切鉴定敲除效率为48%，其2、3、4、5号单克隆细胞敲除效率分别为20%、40%、30%、20%。PCR产物连接T载体后测序，结果显示3组出现点突变，2号为A突变为G，4号为T突变为C和5号为A突变为G，而3号单克隆敲入38 bp碱基，确定为有意义的突变。2、3、4号单克隆细胞CXCR4蛋白表达量为0，敲除组CXCR4蛋白相对表达量较对照组明显降低(0比0.746±0.010，P＝0.000)，差异有统计学意义。免疫印迹结果说明敲除CXCR4基因的U251细胞株内无CXCR4蛋白的表达；测序比对得到有效的敲除细胞株。
结论通过CRISPR/Cas9系统高效地获得了靶向CXCR4重组质粒，并且筛选出稳定敲除CXCR4表达的U251细胞株。