探讨环状RNA(circular RNA,circRNA)BICD2(circ-BICD2)对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)谷氨酰胺代谢、细胞增殖、迁移侵袭、凋亡的影响和可能机制。
方法纳入2016年1月至2018年1月就诊于郑州大学第一附属医院口腔科,手术切除的35例OSCC患者的肿瘤组织及其癌旁正常组织样本。通过实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和蛋白质印迹法检测OSCC组织与癌旁组织、OSCC细胞(CAL27、SCC9、SCC15)与正常上皮细胞HIOEC细胞中circ-BICD2、miR-296-5p和转录球蛋白2(transgelin2,TAGLN2)的表达水平。生物信息学方法、双荧光素酶报告实验、RNA结合免疫沉淀反应(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)实验检测circ-BICD2与miR-296-5p、miR-296-5p与TAGLN2的靶向关系。在CAL27和SCC9细胞中分别转染circ-BICD2小干扰RNAsi-circ-BICD2#1(敲低1组)、si-circ-BICD2#2(敲低2组)及阴性对照si-NC(siRNA空白组);在敲低1组细胞中分别转染miR-296-5p抑制物anti-miR-296-5p(抑制物组)及其阴性对照anti-miR-NC(抑制物对照组)。在CAL27和SCC9细胞中转染miR-296-5p模拟物(miR过表达组)及其阴性对照miR-NC(miR空白组)。在miR过表达组细胞中转染TAGLN2(共转染组)及空白质粒pcDNA(共转染对照组)。运用细胞计数试剂盒(cell counting kit 8,CCK-8)、集落形成实验、流式细胞术、划痕愈合实验、Transwell实验等检测OSCC生物学行为。同时检测谷氨酰胺(glutamine,gln)消耗量、α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)产生量和ATP浓度观察其对细胞代谢的影响。蛋白质印迹法检测各组CAL27和SCC9细胞中的细胞周期素D1(cyclinD1)和谷氨酰胺水解酶(glutamine hydrolase,GLS1)蛋白表达量。取4周龄清洁级BALB/c雌性裸鼠12只,于腋下皮肤分别注射转染sh-circ-BICD2(敲低组)和sh-NC(对照组)后的SCC9细胞单细胞悬液,建立移植瘤模型,每组6只。注射32 d时断颈处死裸鼠并切除肿瘤,检测肿瘤质量及两组的circ-BICD2、miR-296-5p及TAGLN2的表达水平。
结果OSCC组织中circ-BICD2、TAGLN2表达量(分别为2.54±0.71和1.86±0.15)显著高于正常组织(分别为1.00±0.35和1.00±0.11),miR-296-5p表达量(0.56±0.23)显著低于正常组织(1.00±0.32)(P<0.05)。敲低1组CAL27和SCC9细胞活力、克隆形成数、迁移率、侵袭细胞数、S期细胞比例、gln消耗量、α-KG产生量、ATP浓度、cyclinD1和GLS1蛋白表达均显著低于siRNA空白组,细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例显著高于siRNA空白组(P<0.05)。与抑制物对照组相比,抑制物组CAL27和SCC9细胞miR-296-5p表达显著降低,细胞活力、克隆形成数、迁移率、侵袭细胞数、S期细胞比例、gln消耗量、α-KG产生量、ATP浓度、cyclinD1和GLS1蛋白表达均显著升高,细胞凋亡率、G0-G1期细胞比例显著降低(P<0.05)。与miR空白组相比,miR过表达组CAL27和SCC9细胞TAGLN2 mRNA、蛋白表达量均显著降低。与共转染对照组比较,共转染组CAL27和SCC9细胞TAGLN2 mRNA、蛋白表达量均显著升高(P<0.05)。动物实验结果显示,与对照组相比,敲低组裸鼠的肿瘤体积、质量、circ-BICD2及TAGLN2的表达水平均显著降低,miR-296-5p表达水平显著升高(P<0.05)。
结论OSCC组织和细胞中circ-BICD2均为高表达,干扰circ-BICD2可抑制OSCC细胞增殖、迁移侵袭、谷氨酰胺代谢以及肿瘤生长,促进细胞凋亡,其机制与调控miR-296-5p/TAGLN2分子轴有关。