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摘要：目的 建立新疆石榴皮HPLC指纹图谱。方法 采用Agilent SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%三氟乙酸溶液，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长370 nm，进样量10 μL，测定12批石榴皮样品，运用相似度分析软件建立石榴皮指纹图谱共有模式，并对色谱峰进行指认。结果 建立了石榴皮HPLC指纹图谱，標定了18个共有峰，3个色谱峰得到指认，分别为α-安石榴苷、β-安石榴苷、鞣花酸。结论 本研究建立的石榴皮HPLC指纹图谱方法稳定可行，可用于控制石榴皮质量。
关键词：石榴皮;指纹图谱;高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）04-0074-04
石榴Punica granatum L.为石榴科Punicaceae石榴属Punica L.落叶灌木或小乔木，别名安石榴[1]。石榴原产于地中海及亚洲西部地区，约公元前2世纪传入我国。目前，我国栽培石榴主要有六大产区，新疆是我国最西部的石榴产区，种植主要分布在喀什、和田等地。石榴是一种药食同源的植物资源，其叶、花、汁、籽、果皮、根皆可入药。研究表明，石榴具有清除自由基、调节血脂、预防心脑血管疾病、抗氧化、抗病毒、抗癌及改善妇女围绝经期综合征等多种生理和药理活性[2]。石榴皮在食品、医药等领域有巨大的
基金项目：新疆维吾尔自治区中医民族医药科技人才项目（2016-3-10）;新疆维吾尔自治区高校科研计划项目（XJEDU2017S021）
通讯作者：高晓黎，E-mail：xli_g@sina.com
应用价值[3-5]，从1963年起收载入《中华人民共和国药典》，用于治疗久泻、久痢、便血、脱肛、崩漏、白带和虫积腹痛。
石榴皮含有多酚、黄酮、氨基酸、微量元素等多种化学成分。石榴多酚是石榴皮中多酚羟基化合物的总称，主要存在于石榴果皮中，约为其干质量的10.4%～21.3%，主要成分包括安石榴苷、没食子酸、表儿茶素、石榴皮鞣素等，其中安石榴苷含量最高[4-5]。安石榴苷是目前发现仅存在于石榴多酚中的特异性成分，也是其主要的单一成分，约占石榴皮总酚含量的65.75%，远高于鞣花酸和石榴皮鞣素等成分，安石榴苷在体内外均具有很强的抗氧化、抗癌、抗菌及抗动脉粥样硬化等作用[6-7]。本试验综合运用相似度评价、主成分分析方法，对石榴皮进行HPLC指纹图谱研究，为其质量控制提供参考。
1 仪器与试药
Agilent1220LC型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），AB135-S型电子天平（瑞士梅特勒公司），HH-S4数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司），KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率200 W，频率40 kHz）。
安石榴苷对照品（批号MUST-17052603，纯度≥98.12）、鞣花酸对照品（批号MUST-18030601，纯度≥99.65），成都曼斯特生物科技有限公司;色谱甲醇，三氟乙酸。12批石榴皮样品（2015年10月采集，S1、S2、S3产地为和田策勒县，S4、S5、S6产地为和田皮山县，S7、S8、S9产地为喀什市，S10、S11、S12产地为喀什叶城县）经新疆医科大学药学院帕丽达·阿不力孜教授鉴定，均为石榴科植物石榴Punica granatum L.的成熟干燥果皮。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.1%三氟乙酸-甲醇，梯度洗脱（0～10 min，5%甲醇;10～25 min，20%甲醇;25～35 min，45%甲醇;35～45 min，65%甲醇），检测波长370 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取适量安石榴苷、鞣花酸对照品，置棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容、摇匀，制成每1 mL各含75 ?g的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备
精密称定25 mg石榴皮，置容量瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定质量，超声处理20 min，放室温至冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀混合，精密吸取5 mL至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀混合，过0.22 μm微孔有机滤膜，即得。
2.4 样品测定
精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，按“2.1”项下条件进样，记录45 min色谱图。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验
取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于0.26%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。
2.5.2 稳定性试验
取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于0.30%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.5.3 重复性试验
按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下条件分析，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于0.5%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。 2.6 指纹图谱的建立
2.6.1 参照峰选择
石榴皮中鞣花酸色谱峰（18号峰）峰形相对比较对称，且含量稳定，故将鞣花酸色谱峰定为石榴皮HPLC指纹图谱的参照峰。
2.6.2 共有峰标定及化学成分指认
取12批石榴皮样品，按“2.3”項下方法制备供试品溶液，进样测定，选择较稳定的色谱峰，结果共标定了18个色谱峰为石榴皮HPLC指纹图谱的共有指纹峰（见图1、图2）。12批石榴皮样品指纹图谱见图3。采用面积归一化法计算，18个共有峰的峰面积之和占总峰面积的90%以上，根据保留时间，指认4号峰为α-安石榴苷，5号峰为β-安石榴苷，18号峰为鞣花酸。以鞣花酸色谱峰作为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果相对峰面积的RSD为0～2.97%，相对保留时间的RSD为0～0.73%，具有非常强的一致性，符合指纹图谱的技术要求（RSD<3%），见表1、表2。
2.6.3 相似度分析
将12批石榴皮HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》软件中，对其相似度进行分析。12批石榴皮指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，指纹特征峰的相对保留时间基本一致，表明四产地的样品差异不大。相似度计算结果（见表3）表明，不同产地石榴皮化学成分的组成基本一致。石榴皮指纹图谱中共标定了18个共有峰，整个色谱图可分为3个区域：第一指纹特征区的保留时间段约在0～22 min处，该区特征指纹峰较多，共6个，其中4号峰为α-安石榴苷，5号峰为β-安石榴苷，且二者相对含量较大，是整个指纹图谱中较为重要的2个峰;第二指纹特征区的保留时间段约在22～28 min处，该区共有5个特征指纹峰，峰形较好且含量相对较小;第三指纹特征区的保留时间段约在28～40 min处，该区共有7个特征指纹峰，18号峰为鞣花酸色谱峰，因其含量较高、峰形较好、基本对称，故以其作为石榴皮HPLC指纹图谱的参照峰。
3 讨论
研究中药指纹图谱主要有化学方法和生物方法两类。化学方法包括HPLC、质谱指纹图谱法、红外光谱指纹图谱法、紫外分光光度法及高效毛细管电泳指纹图谱法;生物方法包括DNA法和生物色谱法。其中以HPLC最为常用，具有较高分离效能、分析速度快、检测灵敏性好、选择性强、应用范围广等优点。本试验建立的石榴皮HPLC指纹图谱信息量大、操作简便、外界因素影响可控，具有较高的色谱重现性且稳定性良好，可用于石榴皮的质量评价。
在流动相的选择上，本试验尝试了甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-乙腈-0.2%三氟乙酸[8]、乙腈-0.1%三氟乙酸、甲醇-0.1%三氟乙酸等溶剂系统作为流动相，结果以乙腈-0.1%三氟乙酸与甲醇-0.1%三氟乙酸作为流动相的分离效果、峰型均相差不大，因此，选择采用甲醇-0.1%三氟乙酸作为流动相进行梯度洗脱。
参考文献：
[1] 蔡霞，刘悦，张芳芳，等.石榴的化学成分与质量控制研究进展[J].世界科学技术-中医药现代化，2014，16（1）：123-129.
[2] 毕晓菲，李勇.石榴化学成分及其保健功能的研究进展[J].现代农业科技，2010（22）：356-360.
[3] 杜欣，叶盛英.石榴叶和石榴皮药理活性研究进展[J].天津药学， 2007，19（2）：64-66.
[4] 林勇.石榴皮的化学、药理与临床研究概述[J].中药材，2010，33（11）：1816-1819.
[5] 付军，李正.石榴皮鞣质的药理学研究进展[J].中国药业，2011，20（24）：92-94.
[6] 李建科，李国秀，赵艳红，等.石榴皮多酚组成分析及其抗氧化活性[J].中国农业科学，2009，42（11）：4035-4041.
[7] JIMENEZ D R M， RAMAZANOV A， SIKORSKI S， et al. A new method of standartization of health-promoting pomegranate fruit （Punica granatum） extract[J]. J Georgian Med News，2006，140：70-77.
[8] 罗玉琴，李洋，热依木古丽·阿布都拉，等.RP-HPLC法同时测定石榴皮提取物阴道泡腾片中安石榴苷和鞣花酸[J].中草药，2011，42（10）：2011-2013.
（收稿日期：2018-05-31）
（修回日期：2018-07-12;编辑：陈静）
关键词：石榴皮;指纹图谱;高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）04-0074-04
石榴Punica granatum L.为石榴科Punicaceae石榴属Punica L.落叶灌木或小乔木，别名安石榴[1]。石榴原产于地中海及亚洲西部地区，约公元前2世纪传入我国。目前，我国栽培石榴主要有六大产区，新疆是我国最西部的石榴产区，种植主要分布在喀什、和田等地。石榴是一种药食同源的植物资源，其叶、花、汁、籽、果皮、根皆可入药。研究表明，石榴具有清除自由基、调节血脂、预防心脑血管疾病、抗氧化、抗病毒、抗癌及改善妇女围绝经期综合征等多种生理和药理活性[2]。石榴皮在食品、医药等领域有巨大的
基金项目：新疆维吾尔自治区中医民族医药科技人才项目（2016-3-10）;新疆维吾尔自治区高校科研计划项目（XJEDU2017S021）
通讯作者：高晓黎，E-mail：xli_g@sina.com
应用价值[3-5]，从1963年起收载入《中华人民共和国药典》，用于治疗久泻、久痢、便血、脱肛、崩漏、白带和虫积腹痛。
石榴皮含有多酚、黄酮、氨基酸、微量元素等多种化学成分。石榴多酚是石榴皮中多酚羟基化合物的总称，主要存在于石榴果皮中，约为其干质量的10.4%～21.3%，主要成分包括安石榴苷、没食子酸、表儿茶素、石榴皮鞣素等，其中安石榴苷含量最高[4-5]。安石榴苷是目前发现仅存在于石榴多酚中的特异性成分，也是其主要的单一成分，约占石榴皮总酚含量的65.75%，远高于鞣花酸和石榴皮鞣素等成分，安石榴苷在体内外均具有很强的抗氧化、抗癌、抗菌及抗动脉粥样硬化等作用[6-7]。本试验综合运用相似度评价、主成分分析方法，对石榴皮进行HPLC指纹图谱研究，为其质量控制提供参考。
1 仪器与试药
Agilent1220LC型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），AB135-S型电子天平（瑞士梅特勒公司），HH-S4数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司），KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率200 W，频率40 kHz）。
安石榴苷对照品（批号MUST-17052603，纯度≥98.12）、鞣花酸对照品（批号MUST-18030601，纯度≥99.65），成都曼斯特生物科技有限公司;色谱甲醇，三氟乙酸。12批石榴皮样品（2015年10月采集，S1、S2、S3产地为和田策勒县，S4、S5、S6产地为和田皮山县，S7、S8、S9产地为喀什市，S10、S11、S12产地为喀什叶城县）经新疆医科大学药学院帕丽达·阿不力孜教授鉴定，均为石榴科植物石榴Punica granatum L.的成熟干燥果皮。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.1%三氟乙酸-甲醇，梯度洗脱（0～10 min，5%甲醇;10～25 min，20%甲醇;25～35 min，45%甲醇;35～45 min，65%甲醇），检测波长370 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取适量安石榴苷、鞣花酸对照品，置棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容、摇匀，制成每1 mL各含75 ?g的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备
精密称定25 mg石榴皮，置容量瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定质量，超声处理20 min，放室温至冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀混合，精密吸取5 mL至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀混合，过0.22 μm微孔有机滤膜，即得。
2.4 样品测定
精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，按“2.1”项下条件进样，记录45 min色谱图。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验
取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于0.26%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。
2.5.2 稳定性试验
取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于0.30%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.5.3 重复性试验
按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下条件分析，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于0.5%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。 2.6 指纹图谱的建立
2.6.1 参照峰选择
石榴皮中鞣花酸色谱峰（18号峰）峰形相对比较对称，且含量稳定，故将鞣花酸色谱峰定为石榴皮HPLC指纹图谱的参照峰。
2.6.2 共有峰标定及化学成分指认
取12批石榴皮样品，按“2.3”項下方法制备供试品溶液，进样测定，选择较稳定的色谱峰，结果共标定了18个色谱峰为石榴皮HPLC指纹图谱的共有指纹峰（见图1、图2）。12批石榴皮样品指纹图谱见图3。采用面积归一化法计算，18个共有峰的峰面积之和占总峰面积的90%以上，根据保留时间，指认4号峰为α-安石榴苷，5号峰为β-安石榴苷，18号峰为鞣花酸。以鞣花酸色谱峰作为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果相对峰面积的RSD为0～2.97%，相对保留时间的RSD为0～0.73%，具有非常强的一致性，符合指纹图谱的技术要求（RSD<3%），见表1、表2。
2.6.3 相似度分析
将12批石榴皮HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》软件中，对其相似度进行分析。12批石榴皮指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，指纹特征峰的相对保留时间基本一致，表明四产地的样品差异不大。相似度计算结果（见表3）表明，不同产地石榴皮化学成分的组成基本一致。石榴皮指纹图谱中共标定了18个共有峰，整个色谱图可分为3个区域：第一指纹特征区的保留时间段约在0～22 min处，该区特征指纹峰较多，共6个，其中4号峰为α-安石榴苷，5号峰为β-安石榴苷，且二者相对含量较大，是整个指纹图谱中较为重要的2个峰;第二指纹特征区的保留时间段约在22～28 min处，该区共有5个特征指纹峰，峰形较好且含量相对较小;第三指纹特征区的保留时间段约在28～40 min处，该区共有7个特征指纹峰，18号峰为鞣花酸色谱峰，因其含量较高、峰形较好、基本对称，故以其作为石榴皮HPLC指纹图谱的参照峰。
3 讨论
研究中药指纹图谱主要有化学方法和生物方法两类。化学方法包括HPLC、质谱指纹图谱法、红外光谱指纹图谱法、紫外分光光度法及高效毛细管电泳指纹图谱法;生物方法包括DNA法和生物色谱法。其中以HPLC最为常用，具有较高分离效能、分析速度快、检测灵敏性好、选择性强、应用范围广等优点。本试验建立的石榴皮HPLC指纹图谱信息量大、操作简便、外界因素影响可控，具有较高的色谱重现性且稳定性良好，可用于石榴皮的质量评价。
在流动相的选择上，本试验尝试了甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-乙腈-0.2%三氟乙酸[8]、乙腈-0.1%三氟乙酸、甲醇-0.1%三氟乙酸等溶剂系统作为流动相，结果以乙腈-0.1%三氟乙酸与甲醇-0.1%三氟乙酸作为流动相的分离效果、峰型均相差不大，因此，选择采用甲醇-0.1%三氟乙酸作为流动相进行梯度洗脱。
参考文献：
[1] 蔡霞，刘悦，张芳芳，等.石榴的化学成分与质量控制研究进展[J].世界科学技术-中医药现代化，2014，16（1）：123-129.
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[3] 杜欣，叶盛英.石榴叶和石榴皮药理活性研究进展[J].天津药学， 2007，19（2）：64-66.
[4] 林勇.石榴皮的化学、药理与临床研究概述[J].中药材，2010，33（11）：1816-1819.
[5] 付军，李正.石榴皮鞣质的药理学研究进展[J].中国药业，2011，20（24）：92-94.
[6] 李建科，李国秀，赵艳红，等.石榴皮多酚组成分析及其抗氧化活性[J].中国农业科学，2009，42（11）：4035-4041.
[7] JIMENEZ D R M， RAMAZANOV A， SIKORSKI S， et al. A new method of standartization of health-promoting pomegranate fruit （Punica granatum） extract[J]. J Georgian Med News，2006，140：70-77.
[8] 罗玉琴，李洋，热依木古丽·阿布都拉，等.RP-HPLC法同时测定石榴皮提取物阴道泡腾片中安石榴苷和鞣花酸[J].中草药，2011，42（10）：2011-2013.
（收稿日期：2018-05-31）
（修回日期：2018-07-12;编辑：陈静）