【摘 要】
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为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(skMLCK)基因有效短发夹RNA (shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭
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为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(skMLCK)基因有效短发夹RNA (shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(hU6-CMV-puror-PloyA)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中skMLCK基因mRNA和蛋白的表达.结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向skMLCKRNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,skMLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)％、(76.4±7.33)％、(20.0±1.8)％;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)％、(42.4±1.6)％、(34.3±1.2)％.结论:成功构建猪skMLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(skMLCK-RNAi-2)具有最佳干扰效果,证实skMLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础.
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