目的探讨流式细胞术检测胞内细胞因子的注意事项。方法制备小鼠脾脏淋巴细胞悬液。采用细胞表面抗原CD4、CD25及细胞核内因子FOXP3染色检测调节T细胞,胞内因子TNF-α的检测采用PMA/Ionomycin,anti-CD3/CD28,PMA/Ionomycin与anti-CD3/CD28联合3种方案进行刺激,比较不同刺激条件下TNF-α胞内因子的表达情况,培养后各组细胞悬液采用固定破膜处理技术进行细胞表面抗原CD3、CD4及细胞内因子TNF-α染色。结果脾脏淋巴细胞悬液制备中研磨、裂解红细胞及染色过程中破膜等操作的不当,均导致前向/侧向(FSC/SSC)点图中目的细胞群模糊不清,从而影响后续分析。新鲜脾脏淋巴细胞得率、CD3~+T淋巴细胞得率及TNF-α表达率与冻存的脾脏各类细胞比较,差别无统计学意义(P>0.05)。胞内因子TNF-α检测结果显示,刺激组PMA/Ionomycin以及anti-CD3/CD28表达率显著高于未刺激组(P<0.05),PMA/Ionomycin与anti-CD3/CD28联合刺激组的表达率也显著高于未刺激组和独立刺激组(P<0.05)。结论流式细胞术胞内细胞因子的检测有很多影响因素,包括脾脏细胞悬液制备中的研磨、裂解红细胞操作,染色处理过程中的破膜、固定,上机检测过程中补偿的调节、对照的设置等均影响实验结果,检测前应注意摸索选择适合待测胞内因子的测定条件。