【摘 要】
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目的探讨CXCR7的shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞HT-29 CXCR7表达的影响。方法设计CXCR7的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的pl
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目的探讨CXCR7的shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞HT-29 CXCR7表达的影响。方法设计CXCR7的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的plVTHM载体连接,构建3种重组穿梭质粒plVTHM shRNA1,plVTHM shRNA2和plVTHM shR-NA3,并转化于DH5α感受态细胞,Amp筛选阳性克隆,抽取质粒行酶切鉴定并测序。分别将3种重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人结肠癌细胞HT-29,实时定量PCR和Western blot分别检测CXCR7 mRNA和蛋白的沉默效果。结果酶切鉴定及测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为6×107TU/mL,4×107TU/mL和5×107TU/mL。感染HT-29后,CXCR7 mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P(0.05);其中以LV-CXCR7 shRNA-2和LV-CXCR7 shRNA-3作用显著,mRNA表达分别下调72%和67%,蛋白表达下调68%和55%(P<0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P(0.05)结论成功构建了3种CXCR7 shRNA慢病毒表达,可有效下调HT-29细胞CXCR7 mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础。
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