背景:骨髓间充质干细胞被认为是构建组织工程骨修复骨与软骨缺损中较为常用的种子细胞,在其基本操作过程中注意常见问题并及时避免,对后期细胞学及组织工程学实验很有意义。目的:通过作者实验操作过程中所遇问题的总结和分析,为初学者和科研人员提供可靠的骨髓间充质干细胞分离培养鉴定方法,减少操作过程中的人为失误和易犯问题。方法:取16只幼年新西兰大白兔作为实验对象,进行髂骨穿刺抽取骨髓液。采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外筛选纯化细胞,并且通过倒置相差显微镜观察其形态学特点、生长曲线和流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞表型。结果与结论:实验过程中前5只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离过程中遇到不同的问题和困难,经认真总结和分析,后11只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离均获成功,在细胞培养过程中未发现细菌污染和细胞老化,第3代骨髓间充质干细胞高表达CD29、CD44抗原,而CD14、CD34抗原低表达,MTT测细胞生长曲线显示P3和P5增殖活性较高。尽管骨髓间充质干细胞分离培养鉴定技术已较为成熟,但是如果操作过程中不注意细节问题,也将会导致实验困难重重或失败。严格执行常规操作步骤可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞,提高成功率,为后续相关细胞实验和动物实验做好准备。