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摘 要 对槟榔茎基腐病的病原菌进行种类鉴定和致病性测定，并对其进行生物学特性测定。形态观察和ITS序列分析结果表明，病原菌为狭长孢灵芝[Ganoderma boninense Pat.]。生物学特性测定结果表明，28 ℃、pH5～7、连续黑暗、蔗糖、大豆蛋白胨或酵母浸膏是菌丝生长最适条件。
关键词 槟榔；茎基腐病；狭长孢灵芝；生物学特性
中图分类号 S432 文献标识码 A
Identification and Biological Characteristics of Areca catechu L.
Basal Stem Rot Pathogen
CHENG Lele， LI Zengping*， MENG Hanhua
College of Environment and Plants Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract Identification and biological characteristics of the pathogen from the basal stem rot disease in arecanut was reported in this study. The fungus was isolated from an infected arecanut tree in Linshui， Hainan Province. According to the observtion of the basidiocarp of the pathogen morphology and microstructure， the pathogen was identified as Ganoderma boninense Pat.. Biological characteristics tests shown that 28 ℃， pH 5～7， continuous darkness， sucrose， soya peptone and yeast extract were the optimum growth conditions for mycelia.
Key words Areca catechu L.； basal stem rot disease； Ganoderma boninense Pat.； biological characters
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.021
槟榔（Areca catechu L.）在中国已有1 500多年的栽培历史，槟榔果为中国四大南药之一，于1953年被列入了《中华人民共和國药典》中，以海南、台湾2省栽培最多[1-2]。槟榔是海南省重要的热带经济作物和景观植物，是海南人民重要的经济来源，据《海南统计年鉴-2016》记录，2015年海南省槟榔种植面积已达到9.8万hm2，总产量达22.9万t[3]。近年来槟榔黄化型病害在海南各市县的槟榔种植区发生十分严重，对槟榔生产影响极大，而槟榔茎腐病和茎基腐病是引起海南槟榔黄化型病害的2种病因。台风是海南常见的自然灾害，台风过后易导致植株受伤，加上海南省高温高湿的气候特点，使病原菌容易侵入，造成茎干和根系受害，受害植株叶片失绿，逐渐黄化，树势衰弱，最后导致植株枯萎死亡。笔者在陵水县光坡镇的槟榔园调查时发现部分槟榔植株感染茎基腐病，在近地面的茎杆基部长有红褐色的灵芝属担子果，此担子果与曾经报道过的引起槟榔茎基腐病的灵芝菌（Ganoderma lucidum）在形态上有较大差异，根据症状特征初步将其诊断为一种新的槟榔茎基腐病。本研究对其进行了病原菌种类鉴定、致病性测定，并测定了其生物学特性，为有效防治海南槟榔黄化型病害提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试样本病样 供试病样采自海南省陵水县光坡镇槟榔园内，从发病槟榔植株的茎基部采集新鲜的担子果，将其放入自封袋内带回室内备用。
1.1.2 供试培养基 供试的培养基为PDA培养基、木屑培养基和Czapek培养基，PDA培养基与Czapek培养基配方参考《植病研究方法》[4]，木屑培养基配方参考李增平等[5]的方法。
1.1.3 ITS分析主要试剂 引物ITS1、ITS4（由华大基因提供），OMEGA Fungal DNA Kit，OMEGA Extraction Kit，DNA Marker DL 2 000，Taq-Mixture等。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分离及致病性测定 （1）病原菌分离：采用常规的组织分离法[4]对病原菌进行分离。
（2）制作接种体：从纯化培养的病原菌菌落上切取1 cm×1 cm大小的菌丝块2块，接种到灭菌好的木屑培养基中制作接种体，置于室温下培养30～40 d。
（3）接种：参考李增平等的接种方法[5]，略有改动，待接种体内的菌丝长满菌袋后，将待接的无病的树龄15 a长果槟榔植株用小刀在近地面茎杆处削一个约3 cm长的平面切口，然后在接种体菌棒上剪开一个大小相近的缺口，将接种体紧贴在槟郎植株切口上，两端附上湿棉花，用保鲜袋包裹固定。采用相同的方法，于不接菌的灭菌木屑培养基上进行接种，作为对照。
（4）观察：接种后定期观察槟榔植株长势，60 d后每30 d观察一次发病情况，并进行拍照和记录。
1.2.2 病原菌鉴定 （1）形态观察。参考《中国真菌志》第十八卷灵芝科、《中国灵芝图鉴》及《海南大型木生真菌的多样性》等参考资料中所使用的方法[6-8]，对样本子实体的宏观特征及显微结构进行染色、拍照和测量，拍照和测量使用的软件为Imagine Pro Plus 5.0。本研究用5%（质量分数）的氢氧化钾作为浮载剂制片，于100倍油镜下进行显微测量。 （2）ITS序列分析。参考彭军等[9]的方法进行rDNA-ITS测序分析（略微修改）：从PDA平板上刮取培养的病原菌菌丝，加液氮进行充分研磨后，使用OMEGA Fungal DNA Kit提取DNA；以通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对所提取DNA的rDNA-ITS片段进行PCR扩增；将扩增产物进行电泳，在500～750 bp范围内获得明亮的条带，使用OMEGA Extraction Kit对产物进行切胶回收，经电泳验证，胶回收产物的条带亦在500～750 bp范围内；最后将胶回收的產物送华大基因进行测序，将测序结果在NCBI网站用Blastn进行比对，分析其相似性。
1.2.3 生物学特性测定 选菌龄一致的培养菌，用灭菌的打孔器在其菌落边缘打取直径约5 mm的圆形菌饼，对其进行生物学特性测定，将菌饼接至平板中央，每个处理重复3～4次，观察其菌落生长情况，待最优条件下菌丝生长至培养皿边缘时取出，用十字交叉法测量菌落直径。除温度测定外，其余均在28 ℃恒温培养箱中培养；除光照测定外，其余均在黑暗条件下培养；碳源和氮源的基础培养基为不加碳源或氮源的Czapek培养基，其余条件下所用培养基均为PDA培养基。相关试验条件设置分别为：
①温度：设置10、15、20、25、26、28、30、32、34、35 ℃共10个温度梯度，置于恒温培养箱中黑暗条件下培养。
②光照：照明灯为15 W，设置连续光照、连续黑暗和光暗交替3种光照条件。
③pH值：将灭菌后的PDA培养基的pH调节至2、3、4、5、6、7、8、9、10共9个梯度。
④碳、氮源：分别称取相同含碳百分比的葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、D-木糖、蔗糖、麦芽糖-α-乳糖、可溶性淀粉、D-山梨醇、肌醇、甘露醇、甘油作碳源；分别称取相同含氮百分比的硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、草酸铵、L-天门冬酰胺、牛肉膏、大豆蛋白胨、酵母浸膏作氮源；设置不加碳源、氮源的培养基作对照。
1.3 数据处理
利用统计软件SAS 9.1.3、Duncan′s multiple range test对数据进行差异显着性分析。
2 结果与分析
2.1 槟榔茎基腐病病害调查
笔者于2015年11月21日在陵水县光坡镇一个槟榔园进行病害调查时，发现有4%的槟榔植株感染茎基腐病。田间发病的槟榔病株从下层叶片开始由外向内部逐渐失绿，叶片从叶柄基部下折倒挂，继而变黄干枯，树势逐渐衰弱，树冠最后干枯死亡；潮湿季节在将死或已病死的槟榔茎杆基部及暴露的根须上长出红褐色担子果，茎基组织和病根呈海绵状湿腐，有时病根表面长有白色菌丝（图1）。
2.2 致病性测定
60 d后检查接种分离菌的槟榔植株茎杆基部，发现接种部位均已长满白色菌丝，病原菌已在茎杆上成功定殖并扩展；120 d后接种部位内部组织变褐，组织开始变软湿腐，顶部嫩叶发黄，中下层叶片失绿发黄并从叶柄基部下折倒挂于茎干上，与田间发病症状表现一致。未接菌的对照植株仅接种部位表面稍变色，内部组织完好，树冠无异常变化（图2）。取发病变色的组织进行分离，重新分离获得了培养形状与最初分离物一致的菌株，表明该菌株为致病菌。
2.3 病原菌鉴定
2.3.1 形态观察 （1）菌落特征。致病菌在PDA培养基中菌落呈圆形，白色，老化后变为乳白色至棕黄色，边缘整齐。在木屑培养基表面长有洁白且致密的菌丝层，接菌约150 d后形成与田间生长类似的担子果（图3）。
（2）子实体。担子果一年生，有粗短的柄，木栓质。菌盖贝壳形，大小为（56.2～100.5）mm×（78.6～95.9）mm，边缘厚约1.9～5.5 mm，基部厚度为30.5～34.3 mm，菌盖边缘橘黄色，中部至基部变为红褐色或黑褐色，有细密清晰的同心环纹和放射状突起的纵脊，具似漆样光泽；边缘钝，干后奶油色。菌肉上层呈褐色，接近菌管处呈深褐色，有明显的环纹，菌肉中有黑色壳质层。菌管木栓质，褐色，孔面新鲜时白色，触摸后变为浅褐色，干后为草黄色；管口略圆形，管壁较厚、全缘，每毫米3～5个。菌柄背生，暗红色，长11.3～49.9 mm，粗20.6～30.7 mm（图4-A）。
（3）显微结构。菌丝系统三体型如图4-B所示。生殖菌丝在棉蓝试剂中被染成蓝色（CB+），透明，薄壁，部分有隔膜，直径4.01～7.34 μm；骨架菌丝在棉蓝试剂中不变蓝（CB-），褐色，厚壁到实心（内腔窄），树状分枝，骨架干直径3.03～8.19 μm，分枝末端形成褐色鞭毛状骨架-缠绕菌丝；缠绕菌丝（CB+），无色，厚壁，有分枝，直径0.92～2.56 μm。皮壳（图4-C）呈拟子实层型，淡褐色到褐色，组成菌丝棍棒状，顶端膨大呈纺锤状。担孢子（图4-D）呈狭长卵圆形（CB-），顶端平截或凸起，内部有一明显的油滴，双层壁，孢壁有疣状纹饰，外壁无色透明，内壁加厚并有小刺，淡黄褐色，大小为（9.771～12.11）μm×（4.670～6.249） μm，平均长为11.05 μm，平均宽为5.36 μm，长宽比（Q）=1.69～2.31，其形态特征与赵继鼎等[6]报道的狭长孢灵芝（Ganoderma boninense Pat.）相似。
2.3.2 rDNA-ITS序列比对 经测序可知，所得rDNA-ITS序列为539 bp，将其在NCBI上进行Blastn比对，所得ITS序列（NCBI登录号为KX499467）与NCBI登录号为KM220584.1、KM271997.1、KM015454.1、KF164430.1等的狭长孢灵芝（Ganoderma boninense Pat.）序列的相似度最高，达99%。 结合传统形态学鉴定和rDNA-ITS序列分析，将此病原菌鉴定为狭长孢灵芝。
2.4 生物学特性测定
2.4.1 不同温度对病原菌菌丝生长的影响 病菌菌丝在15～32 ℃均能生长，适宜生长温度为26～30 ℃，最适生长温度为28 ℃，到34 ℃时停止生长，但是并未死亡，转移至适宜温度时可继续生长（图5）。
2.4.2 不同光照对病原菌菌丝生长的影响 在不同光照条件处理下，病原菌菌丝生长速度差异较大。在连续黑暗条件下菌丝生长速度最快，菌落边缘整齐，菌丝呈透明毛絮状，生长均匀；在连续光照条件下生长最慢，菌丝中部呈乳白色，边缘透明稀薄；在光暗交替条件下菌絲厚薄不均，有明显的层次感（图6）。
2.4.3 不同pH对病原菌菌丝生长的影响 病原菌菌丝在pH3～8均可生长，最适生长的pH为5～6，表明病原菌喜欢偏酸的生长环境，过酸和过碱的环境均不利于菌丝的生长（图7）。
2.4.4 不同碳、氮源对病原菌菌丝生长的影响
在测试的碳源中，以蔗糖为供试碳源的培养基中菌落直径最大，菌丝层较厚，说明以蔗糖为碳源的菌落长势最佳，其次是D-木糖和葡萄糖，在α-乳糖中生长速度最慢，长势最差。从菌落生长厚度来看，在糖类的培养基中菌丝层普遍较厚，菌丝生长较好，表明该病原菌对糖类的利用率比醇类高（表1）。
在测试的氮源中，在以牛肉膏、大豆蛋白胨和酵母浸膏为供试氮源的培养基中，菌落均为乳白色，菌丝层浓厚，三者之中以大豆蛋白胨中的菌落直径最大，但酵母浸膏的菌落直径与其无显著差异，表明大豆蛋白胨和酵母浸膏均为最优氮源；在硝酸盐中的菌落直径普遍大于铵盐，但菌丝层的厚度不如铵盐；在L-天冬酰胺中的菌落较大，且长势良好（表2）。
3 讨论
目前在中国海南并未有由狭长孢灵芝引起槟榔茎基腐病的相关报道，本研究结合形态学鉴定和rDNA-ITS序列分析，确定引起陵水县光坡镇槟榔园中槟榔茎基腐病的病原菌为狭长孢灵芝（G.boninense Pat.），该病原菌的菌丝在黑暗条件下生长速度快；适宜生长的温度为26～30 ℃；最适生长的pH为5～6；在供试的12种碳源中，最优的碳源为蔗糖；在供试的11种氮源中，最优的氮源为大豆蛋白胨和酵母浸膏。据洪祥千等[10]、李增平等[11]、李专[12]、余凤玉等[13]、陈锦平等[14-15]报道，引起槟榔茎干和根部病害的病原菌有：有害木层孔菌（Phellinus noxius）引起槟榔褐根病，炭色焦菌（Ustulina deusta）引起槟榔黑纹根病，以及引起槟榔茎基腐病（或红根病）的灵芝菌（Ganoderma lucidum）。国外有关报道称，槟榔茎基腐病的病原菌也为灵芝（G. lucidium）[16]。由狭长孢灵芝引起的病害症状与大部分病原灵芝菌引起的症状大致相同，均是出现叶片失绿、黄化、枯萎、茎杆或根部组织腐烂，后在茎杆处长出担子果。Pilotti[17]指出狭长孢灵芝主要寄生于棕榈科植物，可引起油棕和椰子发生茎基腐病。关于由狭长孢灵芝引起的油棕茎基腐病研究较多，该病是油棕生产上危害最严重的病害，其对东南亚国家的油棕产业造成了巨大的经济损失，特别是马来西亚和印度尼西亚[18-20]；Peries等于1974年报道称，在斯里兰卡发生的椰子茎腐病是由狭长孢灵芝引起的[21]。在国内，戴玉成等[7-8]分别在《中国灵芝图鉴》和《海南大型木生真菌的多样性》中记录并描述了生长在阔叶树上的狭长孢灵芝，但国内外均未曾见有由狭长孢灵芝引起的槟榔茎基腐病的相关报道。Nawawi等[22]研究了马来西亚半岛上引起油棕茎基腐病的狭长孢灵芝菌丝最适生长温度为27～30 ℃，最适pH为3.7～5.0。海南陵水槟榔上的狭长孢灵芝生长的最适温度与Nawawi等[22]的研究基本一致，但是最适pH有所差异，原因可能是环境条件或病原菌菌株不同所致。由狭长孢灵芝（G. boninense Pat.）引起的槟榔茎基腐病可造成槟榔植株整株死亡，且发病速度较快，建议在生产中发现此病后可将病株连根挖出，晒干烧毁，病穴撒石灰粉消毒，以防止该病的扩散蔓延。
参考文献
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关键词 槟榔；茎基腐病；狭长孢灵芝；生物学特性
中图分类号 S432 文献标识码 A
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Basal Stem Rot Pathogen
CHENG Lele， LI Zengping*， MENG Hanhua
College of Environment and Plants Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract Identification and biological characteristics of the pathogen from the basal stem rot disease in arecanut was reported in this study. The fungus was isolated from an infected arecanut tree in Linshui， Hainan Province. According to the observtion of the basidiocarp of the pathogen morphology and microstructure， the pathogen was identified as Ganoderma boninense Pat.. Biological characteristics tests shown that 28 ℃， pH 5～7， continuous darkness， sucrose， soya peptone and yeast extract were the optimum growth conditions for mycelia.
Key words Areca catechu L.； basal stem rot disease； Ganoderma boninense Pat.； biological characters
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.021
槟榔（Areca catechu L.）在中国已有1 500多年的栽培历史，槟榔果为中国四大南药之一，于1953年被列入了《中华人民共和國药典》中，以海南、台湾2省栽培最多[1-2]。槟榔是海南省重要的热带经济作物和景观植物，是海南人民重要的经济来源，据《海南统计年鉴-2016》记录，2015年海南省槟榔种植面积已达到9.8万hm2，总产量达22.9万t[3]。近年来槟榔黄化型病害在海南各市县的槟榔种植区发生十分严重，对槟榔生产影响极大，而槟榔茎腐病和茎基腐病是引起海南槟榔黄化型病害的2种病因。台风是海南常见的自然灾害，台风过后易导致植株受伤，加上海南省高温高湿的气候特点，使病原菌容易侵入，造成茎干和根系受害，受害植株叶片失绿，逐渐黄化，树势衰弱，最后导致植株枯萎死亡。笔者在陵水县光坡镇的槟榔园调查时发现部分槟榔植株感染茎基腐病，在近地面的茎杆基部长有红褐色的灵芝属担子果，此担子果与曾经报道过的引起槟榔茎基腐病的灵芝菌（Ganoderma lucidum）在形态上有较大差异，根据症状特征初步将其诊断为一种新的槟榔茎基腐病。本研究对其进行了病原菌种类鉴定、致病性测定，并测定了其生物学特性，为有效防治海南槟榔黄化型病害提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试样本病样 供试病样采自海南省陵水县光坡镇槟榔园内，从发病槟榔植株的茎基部采集新鲜的担子果，将其放入自封袋内带回室内备用。
1.1.2 供试培养基 供试的培养基为PDA培养基、木屑培养基和Czapek培养基，PDA培养基与Czapek培养基配方参考《植病研究方法》[4]，木屑培养基配方参考李增平等[5]的方法。
1.1.3 ITS分析主要试剂 引物ITS1、ITS4（由华大基因提供），OMEGA Fungal DNA Kit，OMEGA Extraction Kit，DNA Marker DL 2 000，Taq-Mixture等。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分离及致病性测定 （1）病原菌分离：采用常规的组织分离法[4]对病原菌进行分离。
（2）制作接种体：从纯化培养的病原菌菌落上切取1 cm×1 cm大小的菌丝块2块，接种到灭菌好的木屑培养基中制作接种体，置于室温下培养30～40 d。
（3）接种：参考李增平等的接种方法[5]，略有改动，待接种体内的菌丝长满菌袋后，将待接的无病的树龄15 a长果槟榔植株用小刀在近地面茎杆处削一个约3 cm长的平面切口，然后在接种体菌棒上剪开一个大小相近的缺口，将接种体紧贴在槟郎植株切口上，两端附上湿棉花，用保鲜袋包裹固定。采用相同的方法，于不接菌的灭菌木屑培养基上进行接种，作为对照。
（4）观察：接种后定期观察槟榔植株长势，60 d后每30 d观察一次发病情况，并进行拍照和记录。
1.2.2 病原菌鉴定 （1）形态观察。参考《中国真菌志》第十八卷灵芝科、《中国灵芝图鉴》及《海南大型木生真菌的多样性》等参考资料中所使用的方法[6-8]，对样本子实体的宏观特征及显微结构进行染色、拍照和测量，拍照和测量使用的软件为Imagine Pro Plus 5.0。本研究用5%（质量分数）的氢氧化钾作为浮载剂制片，于100倍油镜下进行显微测量。 （2）ITS序列分析。参考彭军等[9]的方法进行rDNA-ITS测序分析（略微修改）：从PDA平板上刮取培养的病原菌菌丝，加液氮进行充分研磨后，使用OMEGA Fungal DNA Kit提取DNA；以通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对所提取DNA的rDNA-ITS片段进行PCR扩增；将扩增产物进行电泳，在500～750 bp范围内获得明亮的条带，使用OMEGA Extraction Kit对产物进行切胶回收，经电泳验证，胶回收产物的条带亦在500～750 bp范围内；最后将胶回收的產物送华大基因进行测序，将测序结果在NCBI网站用Blastn进行比对，分析其相似性。
1.2.3 生物学特性测定 选菌龄一致的培养菌，用灭菌的打孔器在其菌落边缘打取直径约5 mm的圆形菌饼，对其进行生物学特性测定，将菌饼接至平板中央，每个处理重复3～4次，观察其菌落生长情况，待最优条件下菌丝生长至培养皿边缘时取出，用十字交叉法测量菌落直径。除温度测定外，其余均在28 ℃恒温培养箱中培养；除光照测定外，其余均在黑暗条件下培养；碳源和氮源的基础培养基为不加碳源或氮源的Czapek培养基，其余条件下所用培养基均为PDA培养基。相关试验条件设置分别为：
①温度：设置10、15、20、25、26、28、30、32、34、35 ℃共10个温度梯度，置于恒温培养箱中黑暗条件下培养。
②光照：照明灯为15 W，设置连续光照、连续黑暗和光暗交替3种光照条件。
③pH值：将灭菌后的PDA培养基的pH调节至2、3、4、5、6、7、8、9、10共9个梯度。
④碳、氮源：分别称取相同含碳百分比的葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、D-木糖、蔗糖、麦芽糖-α-乳糖、可溶性淀粉、D-山梨醇、肌醇、甘露醇、甘油作碳源；分别称取相同含氮百分比的硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、草酸铵、L-天门冬酰胺、牛肉膏、大豆蛋白胨、酵母浸膏作氮源；设置不加碳源、氮源的培养基作对照。
1.3 数据处理
利用统计软件SAS 9.1.3、Duncan′s multiple range test对数据进行差异显着性分析。
2 结果与分析
2.1 槟榔茎基腐病病害调查
笔者于2015年11月21日在陵水县光坡镇一个槟榔园进行病害调查时，发现有4%的槟榔植株感染茎基腐病。田间发病的槟榔病株从下层叶片开始由外向内部逐渐失绿，叶片从叶柄基部下折倒挂，继而变黄干枯，树势逐渐衰弱，树冠最后干枯死亡；潮湿季节在将死或已病死的槟榔茎杆基部及暴露的根须上长出红褐色担子果，茎基组织和病根呈海绵状湿腐，有时病根表面长有白色菌丝（图1）。
2.2 致病性测定
60 d后检查接种分离菌的槟榔植株茎杆基部，发现接种部位均已长满白色菌丝，病原菌已在茎杆上成功定殖并扩展；120 d后接种部位内部组织变褐，组织开始变软湿腐，顶部嫩叶发黄，中下层叶片失绿发黄并从叶柄基部下折倒挂于茎干上，与田间发病症状表现一致。未接菌的对照植株仅接种部位表面稍变色，内部组织完好，树冠无异常变化（图2）。取发病变色的组织进行分离，重新分离获得了培养形状与最初分离物一致的菌株，表明该菌株为致病菌。
2.3 病原菌鉴定
2.3.1 形态观察 （1）菌落特征。致病菌在PDA培养基中菌落呈圆形，白色，老化后变为乳白色至棕黄色，边缘整齐。在木屑培养基表面长有洁白且致密的菌丝层，接菌约150 d后形成与田间生长类似的担子果（图3）。
（2）子实体。担子果一年生，有粗短的柄，木栓质。菌盖贝壳形，大小为（56.2～100.5）mm×（78.6～95.9）mm，边缘厚约1.9～5.5 mm，基部厚度为30.5～34.3 mm，菌盖边缘橘黄色，中部至基部变为红褐色或黑褐色，有细密清晰的同心环纹和放射状突起的纵脊，具似漆样光泽；边缘钝，干后奶油色。菌肉上层呈褐色，接近菌管处呈深褐色，有明显的环纹，菌肉中有黑色壳质层。菌管木栓质，褐色，孔面新鲜时白色，触摸后变为浅褐色，干后为草黄色；管口略圆形，管壁较厚、全缘，每毫米3～5个。菌柄背生，暗红色，长11.3～49.9 mm，粗20.6～30.7 mm（图4-A）。
（3）显微结构。菌丝系统三体型如图4-B所示。生殖菌丝在棉蓝试剂中被染成蓝色（CB+），透明，薄壁，部分有隔膜，直径4.01～7.34 μm；骨架菌丝在棉蓝试剂中不变蓝（CB-），褐色，厚壁到实心（内腔窄），树状分枝，骨架干直径3.03～8.19 μm，分枝末端形成褐色鞭毛状骨架-缠绕菌丝；缠绕菌丝（CB+），无色，厚壁，有分枝，直径0.92～2.56 μm。皮壳（图4-C）呈拟子实层型，淡褐色到褐色，组成菌丝棍棒状，顶端膨大呈纺锤状。担孢子（图4-D）呈狭长卵圆形（CB-），顶端平截或凸起，内部有一明显的油滴，双层壁，孢壁有疣状纹饰，外壁无色透明，内壁加厚并有小刺，淡黄褐色，大小为（9.771～12.11）μm×（4.670～6.249） μm，平均长为11.05 μm，平均宽为5.36 μm，长宽比（Q）=1.69～2.31，其形态特征与赵继鼎等[6]报道的狭长孢灵芝（Ganoderma boninense Pat.）相似。
2.3.2 rDNA-ITS序列比对 经测序可知，所得rDNA-ITS序列为539 bp，将其在NCBI上进行Blastn比对，所得ITS序列（NCBI登录号为KX499467）与NCBI登录号为KM220584.1、KM271997.1、KM015454.1、KF164430.1等的狭长孢灵芝（Ganoderma boninense Pat.）序列的相似度最高，达99%。 结合传统形态学鉴定和rDNA-ITS序列分析，将此病原菌鉴定为狭长孢灵芝。
2.4 生物学特性测定
2.4.1 不同温度对病原菌菌丝生长的影响 病菌菌丝在15～32 ℃均能生长，适宜生长温度为26～30 ℃，最适生长温度为28 ℃，到34 ℃时停止生长，但是并未死亡，转移至适宜温度时可继续生长（图5）。
2.4.2 不同光照对病原菌菌丝生长的影响 在不同光照条件处理下，病原菌菌丝生长速度差异较大。在连续黑暗条件下菌丝生长速度最快，菌落边缘整齐，菌丝呈透明毛絮状，生长均匀；在连续光照条件下生长最慢，菌丝中部呈乳白色，边缘透明稀薄；在光暗交替条件下菌絲厚薄不均，有明显的层次感（图6）。
2.4.3 不同pH对病原菌菌丝生长的影响 病原菌菌丝在pH3～8均可生长，最适生长的pH为5～6，表明病原菌喜欢偏酸的生长环境，过酸和过碱的环境均不利于菌丝的生长（图7）。
2.4.4 不同碳、氮源对病原菌菌丝生长的影响
在测试的碳源中，以蔗糖为供试碳源的培养基中菌落直径最大，菌丝层较厚，说明以蔗糖为碳源的菌落长势最佳，其次是D-木糖和葡萄糖，在α-乳糖中生长速度最慢，长势最差。从菌落生长厚度来看，在糖类的培养基中菌丝层普遍较厚，菌丝生长较好，表明该病原菌对糖类的利用率比醇类高（表1）。
在测试的氮源中，在以牛肉膏、大豆蛋白胨和酵母浸膏为供试氮源的培养基中，菌落均为乳白色，菌丝层浓厚，三者之中以大豆蛋白胨中的菌落直径最大，但酵母浸膏的菌落直径与其无显著差异，表明大豆蛋白胨和酵母浸膏均为最优氮源；在硝酸盐中的菌落直径普遍大于铵盐，但菌丝层的厚度不如铵盐；在L-天冬酰胺中的菌落较大，且长势良好（表2）。
3 讨论
目前在中国海南并未有由狭长孢灵芝引起槟榔茎基腐病的相关报道，本研究结合形态学鉴定和rDNA-ITS序列分析，确定引起陵水县光坡镇槟榔园中槟榔茎基腐病的病原菌为狭长孢灵芝（G.boninense Pat.），该病原菌的菌丝在黑暗条件下生长速度快；适宜生长的温度为26～30 ℃；最适生长的pH为5～6；在供试的12种碳源中，最优的碳源为蔗糖；在供试的11种氮源中，最优的氮源为大豆蛋白胨和酵母浸膏。据洪祥千等[10]、李增平等[11]、李专[12]、余凤玉等[13]、陈锦平等[14-15]报道，引起槟榔茎干和根部病害的病原菌有：有害木层孔菌（Phellinus noxius）引起槟榔褐根病，炭色焦菌（Ustulina deusta）引起槟榔黑纹根病，以及引起槟榔茎基腐病（或红根病）的灵芝菌（Ganoderma lucidum）。国外有关报道称，槟榔茎基腐病的病原菌也为灵芝（G. lucidium）[16]。由狭长孢灵芝引起的病害症状与大部分病原灵芝菌引起的症状大致相同，均是出现叶片失绿、黄化、枯萎、茎杆或根部组织腐烂，后在茎杆处长出担子果。Pilotti[17]指出狭长孢灵芝主要寄生于棕榈科植物，可引起油棕和椰子发生茎基腐病。关于由狭长孢灵芝引起的油棕茎基腐病研究较多，该病是油棕生产上危害最严重的病害，其对东南亚国家的油棕产业造成了巨大的经济损失，特别是马来西亚和印度尼西亚[18-20]；Peries等于1974年报道称，在斯里兰卡发生的椰子茎腐病是由狭长孢灵芝引起的[21]。在国内，戴玉成等[7-8]分别在《中国灵芝图鉴》和《海南大型木生真菌的多样性》中记录并描述了生长在阔叶树上的狭长孢灵芝，但国内外均未曾见有由狭长孢灵芝引起的槟榔茎基腐病的相关报道。Nawawi等[22]研究了马来西亚半岛上引起油棕茎基腐病的狭长孢灵芝菌丝最适生长温度为27～30 ℃，最适pH为3.7～5.0。海南陵水槟榔上的狭长孢灵芝生长的最适温度与Nawawi等[22]的研究基本一致，但是最适pH有所差异，原因可能是环境条件或病原菌菌株不同所致。由狭长孢灵芝（G. boninense Pat.）引起的槟榔茎基腐病可造成槟榔植株整株死亡，且发病速度较快，建议在生产中发现此病后可将病株连根挖出，晒干烧毁，病穴撒石灰粉消毒，以防止该病的扩散蔓延。
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