目的:建立放线菌Streptomyces sp.发酵液中bafilomycin A1的鉴别及含量测定的方法。方法:采用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（HPLC-Q-TOF-MS）分析技术进行定性鉴别;采用高效液相色谱法（HPLC法）进行含量测定,使用Ultimate LP-C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,流动相为甲醇-水（85∶15）,流速1.0 mL·min^-1,检测波长247 nm,柱温40℃。结果:bafilomycin A1质量浓度在18.75～600μg·mL^-1范围内线性良好,相关系数为1.0（n=6）;平均回收率为101.4%,RSD为1.3%（<2.0%）;方法的精密度RSD为1.2%。3批发酵样品中bafilomycin A1含量分别为183.69、196.29、198.63μg·mL^-1,均在有效测定范围内。结论:本方法可以用于bafilomycin A1发酵、提炼及纯化过程的含量测定。