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摘要[目的] 为了生产出一种防治辣椒炭疽病的菌肥。[方法]通过在辣椒炭疽病高发病率土壤中筛选出具有拮抗炭疽病的益生菌，将益生菌发酵扩繁后进行肥料堆沤，生产出既能提供植物营养又能拮抗炭疽病菌的菌肥。[结果] 小区试验表明，该微生物菌肥能减少炭疽病害的发生，具有较强的抑制病害发生能力。[结论]针对炭疽病进行微生物筛选且生产出专用菌肥的效果很好， 是一种具有炭疽病防病功能的新型菌肥。
关键词辣椒；炭疽病；新型菌肥
中图分类号S144文献标识码A文章编号0517-6611（2015）31-140-02
Production of Anti Chili Anthrax Bacteriafertilizer and Its Application in Chili Planting
LUO Zhiwei， XU Taoming， ZHOU Fangru， FENG Lai* et al
（Key Laboratory of Plant Nutrition and Biological Fertilizer Ministry of Agriculture/Hunan Taigu BioTech Co.Ltd， Changsha， Hunan 410205）
Abstract[Objective]The research aimed to produce a kind of bacterialfertilizer which had an apparent effect in preventing and curing chili anthrax. [Method] Probiotics with strong antagonism effect to anthrax incidence was extracted. Using this probiotics in ferment and compost， we made a strong anthraxresistent biofertilizer which could both resist anthrax and provide nutrition to the plant.[ Result] The experiment in tested region showed that the biofertilizer had been proved it could reduce and restrain anthrax occurrence. [Conclusion]The bacterialfertilizer extracted and produced to control anthrax is proved very effective. It is a new type of anthraxresistant bacterialfertilizer.
Key words Chili； Anthrax； New type bacterialfertilizer
辣椒是我國重要的蔬菜作物和调味品。目前，全国年种植面积超过6.67万hm2的省有6个，而我国辣椒种植面积约为133万hm2，仅次于白菜类蔬菜，已成为我国栽培面积最大的蔬菜作物之一，占世界辣椒面积的35.0%；辣椒总产量2 800 万t，占世界辣椒总产量的46.0%，经济总产值达700亿元，居蔬菜之首位，占世界蔬菜总产值的16.67%[1～2]。辣椒炭疽病是辣椒上的重要病害之一，可引起辣椒幼苗死亡叶、烂果，通常病果率为15%左右，严重时病果率达30%～40%，是影响我国辣椒生产的主要障碍之一[3]。目前，辣椒炭疽病的防治主要是采取农药喷洒方法防治[4]。常用的农药有多菌灵、克菌丹、代森锰、二噻农等。农药喷洒方法防治不但会杀死病菌，而且会杀死土壤中的有益微生物，长此下去会使得土壤生态环境恶化，同时农药的残留会对人体造成伤害。因此，一种新型的防治辣椒病菌的方法的开发成一种必然趋势。
1材料与方法
1.1试验材料
拮抗微生物收集培养基组成为：酵母浸粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L、营养琼脂18 g/L，pH 70。
拮抗病菌筛选培养基为马铃薯培养基。
供试病菌为辣椒炭疽病菌，由农业部植物营养与生物肥料重点实验室菌种研究中心提供。
1.2生防菌的筛选
1.2.1拮抗微生物的收集。从湖南省浏阳市北盛镇附近农田辣椒炭疽病发病率较高的地方寻找健康植株，取健康植株根部土壤表层以下10～20 cm土壤。按十倍稀释法涂布至培养基中，30 ℃培养1～2 d。待菌落长出后，挑取不同形态的单菌落40余株进行纯化，接种斜面，30 ℃培养2 d，备用。
1.2.2拮抗微生物的筛选[5]。将炭疽病菌用灭菌的打孔器取菌块接种于马铃薯培养基中28 ℃培养，待菌落直径为0.5 cm左右时，将40余株细菌分别接种至炭疽病菌落周围，接种点距炭疽病菌落约1 cm，每个平板接种4株细菌，30 ℃培养，每隔12 h观察细菌与炭疽病病菌对峙生长情况。
1.2.3对峙验证。挑选出细菌抑制炭疽病生长最大的抑菌圈菌株，按“1.2.2”方法进行对峙验证，获得拮抗菌株一株，编号为TGbio1475。
1.2.4菌株的初步鉴定。形态观察和常规染色表明，TGbio-1475菌株的菌体均为杆状，菌落乳白色，周生鞭毛，革兰氏染色呈阳性，产芽孢 ，芽孢椭圆形 。按东秀珠等[6]的方法，确定为芽孢杆菌。
1.3菌肥的生产过程
1.3.1菌种的制作。菌种发酵流程如下：
100 L罐发酵培养基各成分为：酵母浸粉5 g/L、胰蛋白胨 10 g/L、氯化钠 10 g/L、碳酸钙 1.5 g/L，泡敌0.05%，pH 6.8～7.2。发酵罐发酵条件为：培养温度30 ℃，转速180 r/min，通气量1∶1。发酵时间20 h。检测发酵液含菌量为254亿cfu/ml。 1.3.2菌肥的生产。菌肥生产采用二次发酵工艺[7]。发酵饼肥由农业部植物营养与生物肥料重点实验室提供[8]。将豆粕、菜籽粕和芝麻粕按等质量比混合得粕类混合物，向其中添加复合发酵菌剂混匀堆沤发酵，水分控制在 60%；其中，复合发酵菌剂与粕类混合物的质量比为 1∶50；复合发酵菌剂为枯草芽孢杆菌、哈茨木霉的混合菌剂，混合菌剂中总有效活菌数约为 5 亿 cfu/g。当沤堆 15 cm 左右的温度上升至 60 ℃时启动翻堆机进行翻堆，如此反复操作，20 d后溫度降至40 ℃左右，发酵堆水分降至40%左右，加入“1.3.1”发酵所得发酵液，添加量为2%，翻堆机往复开动使得发酵液与饼肥充分混合均匀，每天监控发酵温度，温度超过50 ℃时启动翻堆机进行翻堆，控制发酵堆温度在50 ℃以下，待发酵堆温度降至30 ℃左右，发酵堆水分降至30%以下时并不再升温即可结束发酵。产物即为目的菌肥，检测TGbio1475活菌数为11.4亿cfu/g。
1.4小区试验
试验在浏阳市北盛镇环园村蔬菜大棚进行。
供试土壤的基础理化性状为：pH 6.2，有机质59.8 g/kg，碱解氮192 mg/kg，速效磷7.5 mg/kg，速效钾124 mg/kg。前茬种植炭疽病发病率为23.4%。
供试优质有机肥由农业部植物营养与生物肥料重点实验室提供（有机质45%，总养分≥8%）。过磷酸钙、硫酸钾、尿素等追肥均为市售产品。
供试作为品种为四川种都出品的香辣王。
试验设4个处理：
①未经二次发酵的饼肥+常规施肥；
②二次发酵后的菌肥+常规施肥；
③灭菌后的二次发酵菌肥+常规施肥；
④（CK）常规施肥。
每个试验3次重复，共12个小区，随机区组排列，小区面积33.3 m2。试验地四周设置保护行。常规施肥[9]为优质有机肥7 500 kg/hm2、过磷酸钙4 500 kg/hm2、硫酸钾300 kg/hm2。设计菌肥使用量为1 500 kg/hm2，作为基肥施用。
在2015年3月24日移栽，株高15 cm左右，行距50 cm，株距30 cm，2株一穴。移栽前，于3月20日结合整地施用基肥，基肥用量按上述处理进行。追肥的品种、用量、施用时期均按常规[9]进行。试验田的中耕、除草等栽培管理措施均按当地常规种植进行。炭疽发病植株不做处理，分时间累计计算炭疽病发病率。
2结果与分析
从图1可以看出，炭疽发病率随着生长时间的推移而升高，施用二次发酵的菌肥能显著降低炭疽病的发病率。处理①能够减少辣椒炭疽发病率，可能是因为堆肥发酵添加的微生物发酵剂对炭疽病有抑制作用；处理③能减少辣椒炭疽发病率，可能是因为一次二次发酵的次级代谢产物能够抑制炭疽病的发生。具体机制还有待进一步研究。
3结论与讨论
该研究提出了一种新型的抑制辣椒炭疽病发生的菌肥。目前，通过在前茬高发病率的土地进行小区试验，发现它能够明显降低炭疽病的发病率，但是还需要进一步研究在防治病害发生的同时提高作物产量的菌肥。同时，在大田试验中微生物适应环境能力还有待进一步验证。
该菌肥具有产业化应用前景，但是TGbio1475拮抗菌的发酵工艺有待进一步优化，以适应产业化生产需求。
菌肥选择饼粕作为原材料是一种较优质的原材料，在堆肥发酵过程可以释放许多游离氨基酸，有效促进作物品质的提高。饼肥堆肥工艺需进一步优化，以配合产业化生产。
所以，菌肥可以有效地防治辣椒炭疽病的发生，相较于农药防治来说是一个更加健康、更加环保的的方法。同时，还需要进一步对TGbio1475进行深度研究，以便生产出效果更佳、更利于辣椒增产增收的新型肥料。
参考文献
[1] 马艳青.我国辣椒产业形势分析[J].辣椒杂志，2011（1）：1-5.
[2] 王文霞.辣椒的生产现状及发展[J].北京农业，2014（18）：58-59.
[3] 杨青.辣椒炭疽病菌生防菌的筛选、鉴定及应用[D].长沙：湖南农业大学，2012.
[4] 张京社、郭伟民.辣椒主要病害的防治及抗病性筛选技术[J].北方园艺，1994（6）：49.
[5] 黄河，鄢凯舟，林元山，等.水稻纹枯病拮抗细菌的筛选、鉴定及其活性成分的发酵制备[J].安徽农业科学，2014，42（25）：8584-8586，8647.
[6] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
[7] 刘锐，方亚曼.高效微生物菌剂在猪粪堆肥中的应用[J].安徽农业科学，2011，39（18）：10885-10888.
[8] 湖南泰谷生物科技股份有限公司.用于花生种植的微生物菌肥及其制备方法：中国，103819267[P].2014-05-28.
[9] 奉泽丽.辣椒的施肥技术要点[J].农技服务，2011，28（4）：485，566.
关键词辣椒；炭疽病；新型菌肥
中图分类号S144文献标识码A文章编号0517-6611（2015）31-140-02
Production of Anti Chili Anthrax Bacteriafertilizer and Its Application in Chili Planting
LUO Zhiwei， XU Taoming， ZHOU Fangru， FENG Lai* et al
（Key Laboratory of Plant Nutrition and Biological Fertilizer Ministry of Agriculture/Hunan Taigu BioTech Co.Ltd， Changsha， Hunan 410205）
Abstract[Objective]The research aimed to produce a kind of bacterialfertilizer which had an apparent effect in preventing and curing chili anthrax. [Method] Probiotics with strong antagonism effect to anthrax incidence was extracted. Using this probiotics in ferment and compost， we made a strong anthraxresistent biofertilizer which could both resist anthrax and provide nutrition to the plant.[ Result] The experiment in tested region showed that the biofertilizer had been proved it could reduce and restrain anthrax occurrence. [Conclusion]The bacterialfertilizer extracted and produced to control anthrax is proved very effective. It is a new type of anthraxresistant bacterialfertilizer.
Key words Chili； Anthrax； New type bacterialfertilizer
辣椒是我國重要的蔬菜作物和调味品。目前，全国年种植面积超过6.67万hm2的省有6个，而我国辣椒种植面积约为133万hm2，仅次于白菜类蔬菜，已成为我国栽培面积最大的蔬菜作物之一，占世界辣椒面积的35.0%；辣椒总产量2 800 万t，占世界辣椒总产量的46.0%，经济总产值达700亿元，居蔬菜之首位，占世界蔬菜总产值的16.67%[1～2]。辣椒炭疽病是辣椒上的重要病害之一，可引起辣椒幼苗死亡叶、烂果，通常病果率为15%左右，严重时病果率达30%～40%，是影响我国辣椒生产的主要障碍之一[3]。目前，辣椒炭疽病的防治主要是采取农药喷洒方法防治[4]。常用的农药有多菌灵、克菌丹、代森锰、二噻农等。农药喷洒方法防治不但会杀死病菌，而且会杀死土壤中的有益微生物，长此下去会使得土壤生态环境恶化，同时农药的残留会对人体造成伤害。因此，一种新型的防治辣椒病菌的方法的开发成一种必然趋势。
1材料与方法
1.1试验材料
拮抗微生物收集培养基组成为：酵母浸粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L、营养琼脂18 g/L，pH 70。
拮抗病菌筛选培养基为马铃薯培养基。
供试病菌为辣椒炭疽病菌，由农业部植物营养与生物肥料重点实验室菌种研究中心提供。
1.2生防菌的筛选
1.2.1拮抗微生物的收集。从湖南省浏阳市北盛镇附近农田辣椒炭疽病发病率较高的地方寻找健康植株，取健康植株根部土壤表层以下10～20 cm土壤。按十倍稀释法涂布至培养基中，30 ℃培养1～2 d。待菌落长出后，挑取不同形态的单菌落40余株进行纯化，接种斜面，30 ℃培养2 d，备用。
1.2.2拮抗微生物的筛选[5]。将炭疽病菌用灭菌的打孔器取菌块接种于马铃薯培养基中28 ℃培养，待菌落直径为0.5 cm左右时，将40余株细菌分别接种至炭疽病菌落周围，接种点距炭疽病菌落约1 cm，每个平板接种4株细菌，30 ℃培养，每隔12 h观察细菌与炭疽病病菌对峙生长情况。
1.2.3对峙验证。挑选出细菌抑制炭疽病生长最大的抑菌圈菌株，按“1.2.2”方法进行对峙验证，获得拮抗菌株一株，编号为TGbio1475。
1.2.4菌株的初步鉴定。形态观察和常规染色表明，TGbio-1475菌株的菌体均为杆状，菌落乳白色，周生鞭毛，革兰氏染色呈阳性，产芽孢 ，芽孢椭圆形 。按东秀珠等[6]的方法，确定为芽孢杆菌。
1.3菌肥的生产过程
1.3.1菌种的制作。菌种发酵流程如下：
100 L罐发酵培养基各成分为：酵母浸粉5 g/L、胰蛋白胨 10 g/L、氯化钠 10 g/L、碳酸钙 1.5 g/L，泡敌0.05%，pH 6.8～7.2。发酵罐发酵条件为：培养温度30 ℃，转速180 r/min，通气量1∶1。发酵时间20 h。检测发酵液含菌量为254亿cfu/ml。 1.3.2菌肥的生产。菌肥生产采用二次发酵工艺[7]。发酵饼肥由农业部植物营养与生物肥料重点实验室提供[8]。将豆粕、菜籽粕和芝麻粕按等质量比混合得粕类混合物，向其中添加复合发酵菌剂混匀堆沤发酵，水分控制在 60%；其中，复合发酵菌剂与粕类混合物的质量比为 1∶50；复合发酵菌剂为枯草芽孢杆菌、哈茨木霉的混合菌剂，混合菌剂中总有效活菌数约为 5 亿 cfu/g。当沤堆 15 cm 左右的温度上升至 60 ℃时启动翻堆机进行翻堆，如此反复操作，20 d后溫度降至40 ℃左右，发酵堆水分降至40%左右，加入“1.3.1”发酵所得发酵液，添加量为2%，翻堆机往复开动使得发酵液与饼肥充分混合均匀，每天监控发酵温度，温度超过50 ℃时启动翻堆机进行翻堆，控制发酵堆温度在50 ℃以下，待发酵堆温度降至30 ℃左右，发酵堆水分降至30%以下时并不再升温即可结束发酵。产物即为目的菌肥，检测TGbio1475活菌数为11.4亿cfu/g。
1.4小区试验
试验在浏阳市北盛镇环园村蔬菜大棚进行。
供试土壤的基础理化性状为：pH 6.2，有机质59.8 g/kg，碱解氮192 mg/kg，速效磷7.5 mg/kg，速效钾124 mg/kg。前茬种植炭疽病发病率为23.4%。
供试优质有机肥由农业部植物营养与生物肥料重点实验室提供（有机质45%，总养分≥8%）。过磷酸钙、硫酸钾、尿素等追肥均为市售产品。
供试作为品种为四川种都出品的香辣王。
试验设4个处理：
①未经二次发酵的饼肥+常规施肥；
②二次发酵后的菌肥+常规施肥；
③灭菌后的二次发酵菌肥+常规施肥；
④（CK）常规施肥。
每个试验3次重复，共12个小区，随机区组排列，小区面积33.3 m2。试验地四周设置保护行。常规施肥[9]为优质有机肥7 500 kg/hm2、过磷酸钙4 500 kg/hm2、硫酸钾300 kg/hm2。设计菌肥使用量为1 500 kg/hm2，作为基肥施用。
在2015年3月24日移栽，株高15 cm左右，行距50 cm，株距30 cm，2株一穴。移栽前，于3月20日结合整地施用基肥，基肥用量按上述处理进行。追肥的品种、用量、施用时期均按常规[9]进行。试验田的中耕、除草等栽培管理措施均按当地常规种植进行。炭疽发病植株不做处理，分时间累计计算炭疽病发病率。
2结果与分析
从图1可以看出，炭疽发病率随着生长时间的推移而升高，施用二次发酵的菌肥能显著降低炭疽病的发病率。处理①能够减少辣椒炭疽发病率，可能是因为堆肥发酵添加的微生物发酵剂对炭疽病有抑制作用；处理③能减少辣椒炭疽发病率，可能是因为一次二次发酵的次级代谢产物能够抑制炭疽病的发生。具体机制还有待进一步研究。
3结论与讨论
该研究提出了一种新型的抑制辣椒炭疽病发生的菌肥。目前，通过在前茬高发病率的土地进行小区试验，发现它能够明显降低炭疽病的发病率，但是还需要进一步研究在防治病害发生的同时提高作物产量的菌肥。同时，在大田试验中微生物适应环境能力还有待进一步验证。
该菌肥具有产业化应用前景，但是TGbio1475拮抗菌的发酵工艺有待进一步优化，以适应产业化生产需求。
菌肥选择饼粕作为原材料是一种较优质的原材料，在堆肥发酵过程可以释放许多游离氨基酸，有效促进作物品质的提高。饼肥堆肥工艺需进一步优化，以配合产业化生产。
所以，菌肥可以有效地防治辣椒炭疽病的发生，相较于农药防治来说是一个更加健康、更加环保的的方法。同时，还需要进一步对TGbio1475进行深度研究，以便生产出效果更佳、更利于辣椒增产增收的新型肥料。
参考文献
[1] 马艳青.我国辣椒产业形势分析[J].辣椒杂志，2011（1）：1-5.
[2] 王文霞.辣椒的生产现状及发展[J].北京农业，2014（18）：58-59.
[3] 杨青.辣椒炭疽病菌生防菌的筛选、鉴定及应用[D].长沙：湖南农业大学，2012.
[4] 张京社、郭伟民.辣椒主要病害的防治及抗病性筛选技术[J].北方园艺，1994（6）：49.
[5] 黄河，鄢凯舟，林元山，等.水稻纹枯病拮抗细菌的筛选、鉴定及其活性成分的发酵制备[J].安徽农业科学，2014，42（25）：8584-8586，8647.
[6] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
[7] 刘锐，方亚曼.高效微生物菌剂在猪粪堆肥中的应用[J].安徽农业科学，2011，39（18）：10885-10888.
[8] 湖南泰谷生物科技股份有限公司.用于花生种植的微生物菌肥及其制备方法：中国，103819267[P].2014-05-28.
[9] 奉泽丽.辣椒的施肥技术要点[J].农技服务，2011，28（4）：485，566.