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摘要：PIN2蛋白作为生长素外排蛋白，在植物根的向地性生长中起重要作用。免疫定位法是一种可以将蛋白在植物细胞中快速准确定位的方法。本研究利用改良的免疫荧光定位法，对PIN2蛋白在水稻根尖细胞中的定位进行了观察，并与前人的两种方法进行比较。结果表明，与已有的方案比较，改良免疫荧光定位法可使PIN2蛋白在水稻根尖细胞中的位置快速准确地被观察到，且简化了操作步骤，操作方便快速，可广泛应用于植物其他蛋白的定位研究。
关键词：PIN2蛋白；免疫荧光定位；水稻；根尖细胞
中图分类号：S511+S188+.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）08-0104-03
Abstract PIN2 as an auxin efflux protein plays important roles in geotropic growth of plant roots. Immunolocalization technique is a method which allows rapid and reliable in situ localization of proteins in plant cells. In this paper， the improved immunolocalization technique was used to localize the PIN2 in root tip cells of rice， and its effect was compared to the two existing methods. The results showed that the location of PIN2 could be more quickly and accurately determined in root tip cells of rice by the improved method； and the improved method simplified the operation procedures and was more convenient， so it could be used for the localization researches of other plant proteins in the future.
Key words PIN2 protein； Immunolocalization； Rice； Cells of root tips
PIN蛋白家族定位于细胞膜，而这种极性定位决定了生长素的极性流向及梯度分布[1～3]，植物通过维持PIN蛋白在内吞循环途径及液泡降解与储存途径间的动态平衡，控制生长素的极性运输效率[4，5]。生长素极性运输在植物胚胎、侧生器官的发生与发育、向性生长中起了关键性的调控作用，已成为植物发育生物学领域中的研究热点之一[6]。PIN2蛋白属于生长素的外排蛋白，在植物根尖表皮层及真皮层细胞中表达，主要在植物根向地性生长中起作用[7]。植物根系的向地性决定着根系空间生长的趋势，对植物养分的吸收 （特别是磷的吸收）具有着重要的影响[8]。因此，深入研究植物根系向地性的分子机制及PIN2蛋白在植物根系中的定位对于植物根系遗传改良具有实践和理论的指导意义。
蛋白质的功能、相互联系或活性的研究需要一种在细胞及亚细胞水平对蛋白定位的可靠分析方法。Brandizzi等[9]采用DNA与荧光蛋白重组技术研究了活体内蛋白的亚细胞定位，其缺点为重组的蛋白质分子特性已改变，可能不会精确定位，基于蛋白抗体的免疫定位则克服了这一缺陷。Lauber[10]和Friml等[11]提出了适于小段组织蛋白免疫定位的方案；Sauer等[12]在他们的方法上进行了改进，使其更加省时、简便、可自动化。目前，免疫定位技术被广泛应用于拟南芥、烟草、马铃薯等植物的研究中，而水稻根尖组织中蛋白的免疫定位尚未见报道。由于水稻细胞壁拥有“角质-双硅层”结构，降低了细胞的相对透性[13]，对蛋白免疫定位有较大的干扰。本研究在Friml和Michael的方法上进一步对实验试剂、承载体及操作步骤进行了优化，采用改进的免疫荧光方法，以水稻根尖组织作为供试材料，观察了PIN2蛋白的定位，并与Friml和Sauer的方法进行分析比较，力求寻找一种简便快速、可用于水稻根尖细胞中蛋白精确定位的方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为野生型水稻LTH，由云南农业大学植物病理重点实验室提供。
1.2 仪器及试剂
仪器：96孔板，载玻片，真空泵，激光共聚焦显微镜（Leica confocal microscope SP5）。
试剂：磷酸盐缓冲液（PBS），pH 8.06；一抗PIN2-驴抗羊IgG；二抗驴抗鸡IgG。
1.3 试验方法
分别对改良的免疫荧光定位法、Friml和Sauer的蛋白定位方法进行分析比较，具体方法如下。
1.3.1 改良免疫荧光定位法 ①取水稻苗期1 cm根尖组织，置于96孔板内。②向装有根尖组织的孔内加入适量4%多聚甲醛固定液，于真空状态下室温固定1 h；用PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，再用双蒸水吹洗2次，每次吹洗均为10 min；最后将根尖组织浸泡于双蒸水，37℃放置12 min。③用崩溃酶于37℃处理1 h，PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，每次12 min；加适量渗透液（含10% DMSO和2% Nonidet-P40），室温处理1.5 h，PBS吹洗6次，每次10 min。④加适量2% BSA，于37℃封闭1 h；加入一抗，于4℃放置过夜；用PBS+0.3% Triton X-100吹洗5次，每次12 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，每次12 min。⑥在载玻片上滴一滴抗荧光猝灭封片液，将处理的根尖组织放入其中，压片后用激光共聚焦显微镜观察。 1.3.2 Friml的方法 ①取水稻苗期1 cm根尖组织。②使用4%多聚甲醛固定液，于真空状态下室温固定1 h；用PBS和ddH2O分别吹洗2次，每次10 min；将根尖组织置于载玻片上，液氮冷冻干燥后浸泡于PBS中10 min。③用崩溃酶于37℃处理40 min，PBS吹洗4次，每次5 min；加适量渗透液（含10% DMSO和1% Nonidet-P40），室温处理1 h，用PBS吹洗6次，每次5 min。④加适量2% BSA，于37℃封闭2 h；加入一抗，于4℃放置过夜；用PBS吹洗6次，每次5 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS和ddH2O分别吹洗2次，每次5 min。⑥在载玻片上滴一滴抗荧光猝灭封片液，将处理的根尖组织放入其中，压片后用激光共聚焦显微镜观察。
1.3.3 Sauer的方法 ①取水稻苗期1 cm根尖组织置于微量离心管中。②加入固定液（含4%多聚甲醛，1×PBS和0.1% Triton X-100），于真空状态下室温固定1 h；用PBS和ddH2O分别吹洗2次，每次10 min；将根尖组织置于显微镜载玻片上，加一滴水，室温过夜干燥。③用PBS浸泡5 min，2%崩溃酶于37℃处理1 h，再用PBS吹洗6次，每次5 min；加适量渗透液（含10% DMSO和3% IGEPAL CA-630），室温处理1 h， PBS吹洗6次，每次5 min。④加适量3% BSA，于室温封闭1 h；加入一抗，于4℃放置过夜；用PBS吹洗6次，每次10 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS吹洗6次，每次10 min。⑥在载玻片上滴一滴抗荧光猝灭封片液，将处理的根尖组织放入其中，压片后用激光共聚焦显微镜观察。
2 结果与分析
2.1 水稻根尖组织染色结果
在激光共聚焦显微镜下观察，看到Friml和Sauer方法的部分水稻根尖组织染色效果较混乱，不易于观察目的蛋白的精确定位；而改进的免疫荧光定位法，大部分水稻根尖组织染色效果较清晰，目的蛋白可以较精确定位（图1）。可见，改良免疫荧光定位法对水稻根尖组织PIN2蛋白的定位效果要好于Friml和Sauer方法。
2.2 免疫荧光标记蛋白结果
观察实验中根尖分生区与伸长区的细胞染色结果（图2），看到细胞膜均被染色，且染色效果较清晰；PIN2蛋白主要分布于细胞膜，这与染色结果相符合，但是细胞表面有多余非特异信号。
3 讨论
本试验主要从以下几点对Friml和Sauer的方法进行了优化：①引入了96孔板，使操作均在96孔板中进行；②调整了处理及吹洗时间；③调整了试剂浓度；④多次使用Triton X-100对根尖组织进行处理；⑤简化了实验步骤。改良之后的方法缩短了整个实验过程，96孔板的使用可以使多个平行实验同时进行，吹洗更加彻底，实验操作方便快捷，处理效果得到优化。
本研究对水稻根尖细胞中蛋白定位的三种方法进行了比较，结果表明，改进后的实验方案使水稻根尖细胞中目的蛋白PIN2的定位清晰可见，并且实验步骤简化，操作方便快速，提高了实验效率。PIN2作为生长素的外排蛋白，其研究对于探究根发育的分子机制及推进作物生长发育的优化改良有重大意义，同时，为其它参与内吞作用的蛋白的定位提供了较好的方法，有助于深入研究内吞作用的机制。
由于操作步骤简化，改良的免疫荧光定位法存在一定的缺陷，如仍存在有多余非特异信号等，分析其原因可能是与相应抗原发生了交叉反应，因此本方案仍需要进一步的改进研究。
参 考 文 献：
[1] Glweiler L， Guan C， Müller A， et al. Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue[J]. Science， 1998， 282（5397）： 2226 -2230.
[2] Wisniewska J， Xu J， Seifertova D， et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants[J]. Science， 2006， 312（5775）： 883.
[3] Grieneisen V A， Xu J， Marée A F， et al. Auxin transport is sufficient to generate a maximum and gradient guiding root growth[J]. Nature， 2007， 449 （7165）： 1008 -1013.
[4] Paciorek T， Zazímalová E， Ruthardt N， et al. Auxin inhibits endocytosis and promotes its own efflux from cells[J]. Nature， 2005， 435（7046）： 1251-1256.
[5] Pan J W， Fujioka S， Peng J L， et al. The E3 ubiquitin ligase SCF TIR1/AFB and membrane sterols play key roles in auxin regulation of endocytosis， recycling， and plasma membrane accumulation of the auxin efflux transporter PIN2 in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell， 2009， 21（2）： 568-580. [6] 潘建伟， 叶晓帆， 王超， 等. 拟南芥PIN2介导的生长素极性运输调控植物根向地性[J]. 浙江师范大学学报：自然科学版， 2010， 33 （1）： 1-6.
[7] Chen R， Hilson P， Sedbrook J， et al. The Arabidopsis thaliana AGRAVITROPIC 1 gene encodes a component of the polar- auxin- transport efflux carrier [J]. PNAS， 1998， 95（25）： 15112-15117.
[8] 石江华， 廖红， 严小龙. 植物根系向地性感应的分子机理与养分吸收 [J]. 植物学通报， 2005， 22（5）： 523-531.
[9] Brandizzi F， Fricker M，Hawes C. A greener world： the revolution in plant bioimaging [J]. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.， 2002，3（7）：520 -530.
[10]Lauber M H， Waizengger I，Steinmann T，et al. The Arabidopsis KNOLLE protein is a cytokinesis-specific syntaxin [J]. J. Cell Biol.，1997，139：1485-1493.
[11]Friml J，Benková E， Mayer U，et al. Automated wholemount localization techniques for plant seedlings [J]. Plant J.， 2003，34：115-124.
[12]Sauer M，Paciorek T，Benková E，et al. Immunocytochemical techniques for whole-mount in situprotein localization in plants [J]. Nature Protocols， 2006， 1 （1）： 98-103.
[13]Ma J F， Takahashi E. Soil， fertilizer and plant silicon research in Japan [M]. Elsevier，2002.
关键词：PIN2蛋白；免疫荧光定位；水稻；根尖细胞
中图分类号：S511+S188+.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）08-0104-03
Abstract PIN2 as an auxin efflux protein plays important roles in geotropic growth of plant roots. Immunolocalization technique is a method which allows rapid and reliable in situ localization of proteins in plant cells. In this paper， the improved immunolocalization technique was used to localize the PIN2 in root tip cells of rice， and its effect was compared to the two existing methods. The results showed that the location of PIN2 could be more quickly and accurately determined in root tip cells of rice by the improved method； and the improved method simplified the operation procedures and was more convenient， so it could be used for the localization researches of other plant proteins in the future.
Key words PIN2 protein； Immunolocalization； Rice； Cells of root tips
PIN蛋白家族定位于细胞膜，而这种极性定位决定了生长素的极性流向及梯度分布[1～3]，植物通过维持PIN蛋白在内吞循环途径及液泡降解与储存途径间的动态平衡，控制生长素的极性运输效率[4，5]。生长素极性运输在植物胚胎、侧生器官的发生与发育、向性生长中起了关键性的调控作用，已成为植物发育生物学领域中的研究热点之一[6]。PIN2蛋白属于生长素的外排蛋白，在植物根尖表皮层及真皮层细胞中表达，主要在植物根向地性生长中起作用[7]。植物根系的向地性决定着根系空间生长的趋势，对植物养分的吸收 （特别是磷的吸收）具有着重要的影响[8]。因此，深入研究植物根系向地性的分子机制及PIN2蛋白在植物根系中的定位对于植物根系遗传改良具有实践和理论的指导意义。
蛋白质的功能、相互联系或活性的研究需要一种在细胞及亚细胞水平对蛋白定位的可靠分析方法。Brandizzi等[9]采用DNA与荧光蛋白重组技术研究了活体内蛋白的亚细胞定位，其缺点为重组的蛋白质分子特性已改变，可能不会精确定位，基于蛋白抗体的免疫定位则克服了这一缺陷。Lauber[10]和Friml等[11]提出了适于小段组织蛋白免疫定位的方案；Sauer等[12]在他们的方法上进行了改进，使其更加省时、简便、可自动化。目前，免疫定位技术被广泛应用于拟南芥、烟草、马铃薯等植物的研究中，而水稻根尖组织中蛋白的免疫定位尚未见报道。由于水稻细胞壁拥有“角质-双硅层”结构，降低了细胞的相对透性[13]，对蛋白免疫定位有较大的干扰。本研究在Friml和Michael的方法上进一步对实验试剂、承载体及操作步骤进行了优化，采用改进的免疫荧光方法，以水稻根尖组织作为供试材料，观察了PIN2蛋白的定位，并与Friml和Sauer的方法进行分析比较，力求寻找一种简便快速、可用于水稻根尖细胞中蛋白精确定位的方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为野生型水稻LTH，由云南农业大学植物病理重点实验室提供。
1.2 仪器及试剂
仪器：96孔板，载玻片，真空泵，激光共聚焦显微镜（Leica confocal microscope SP5）。
试剂：磷酸盐缓冲液（PBS），pH 8.06；一抗PIN2-驴抗羊IgG；二抗驴抗鸡IgG。
1.3 试验方法
分别对改良的免疫荧光定位法、Friml和Sauer的蛋白定位方法进行分析比较，具体方法如下。
1.3.1 改良免疫荧光定位法 ①取水稻苗期1 cm根尖组织，置于96孔板内。②向装有根尖组织的孔内加入适量4%多聚甲醛固定液，于真空状态下室温固定1 h；用PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，再用双蒸水吹洗2次，每次吹洗均为10 min；最后将根尖组织浸泡于双蒸水，37℃放置12 min。③用崩溃酶于37℃处理1 h，PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，每次12 min；加适量渗透液（含10% DMSO和2% Nonidet-P40），室温处理1.5 h，PBS吹洗6次，每次10 min。④加适量2% BSA，于37℃封闭1 h；加入一抗，于4℃放置过夜；用PBS+0.3% Triton X-100吹洗5次，每次12 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，每次12 min。⑥在载玻片上滴一滴抗荧光猝灭封片液，将处理的根尖组织放入其中，压片后用激光共聚焦显微镜观察。 1.3.2 Friml的方法 ①取水稻苗期1 cm根尖组织。②使用4%多聚甲醛固定液，于真空状态下室温固定1 h；用PBS和ddH2O分别吹洗2次，每次10 min；将根尖组织置于载玻片上，液氮冷冻干燥后浸泡于PBS中10 min。③用崩溃酶于37℃处理40 min，PBS吹洗4次，每次5 min；加适量渗透液（含10% DMSO和1% Nonidet-P40），室温处理1 h，用PBS吹洗6次，每次5 min。④加适量2% BSA，于37℃封闭2 h；加入一抗，于4℃放置过夜；用PBS吹洗6次，每次5 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS和ddH2O分别吹洗2次，每次5 min。⑥在载玻片上滴一滴抗荧光猝灭封片液，将处理的根尖组织放入其中，压片后用激光共聚焦显微镜观察。
1.3.3 Sauer的方法 ①取水稻苗期1 cm根尖组织置于微量离心管中。②加入固定液（含4%多聚甲醛，1×PBS和0.1% Triton X-100），于真空状态下室温固定1 h；用PBS和ddH2O分别吹洗2次，每次10 min；将根尖组织置于显微镜载玻片上，加一滴水，室温过夜干燥。③用PBS浸泡5 min，2%崩溃酶于37℃处理1 h，再用PBS吹洗6次，每次5 min；加适量渗透液（含10% DMSO和3% IGEPAL CA-630），室温处理1 h， PBS吹洗6次，每次5 min。④加适量3% BSA，于室温封闭1 h；加入一抗，于4℃放置过夜；用PBS吹洗6次，每次10 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS吹洗6次，每次10 min。⑥在载玻片上滴一滴抗荧光猝灭封片液，将处理的根尖组织放入其中，压片后用激光共聚焦显微镜观察。
2 结果与分析
2.1 水稻根尖组织染色结果
在激光共聚焦显微镜下观察，看到Friml和Sauer方法的部分水稻根尖组织染色效果较混乱，不易于观察目的蛋白的精确定位；而改进的免疫荧光定位法，大部分水稻根尖组织染色效果较清晰，目的蛋白可以较精确定位（图1）。可见，改良免疫荧光定位法对水稻根尖组织PIN2蛋白的定位效果要好于Friml和Sauer方法。
2.2 免疫荧光标记蛋白结果
观察实验中根尖分生区与伸长区的细胞染色结果（图2），看到细胞膜均被染色，且染色效果较清晰；PIN2蛋白主要分布于细胞膜，这与染色结果相符合，但是细胞表面有多余非特异信号。
3 讨论
本试验主要从以下几点对Friml和Sauer的方法进行了优化：①引入了96孔板，使操作均在96孔板中进行；②调整了处理及吹洗时间；③调整了试剂浓度；④多次使用Triton X-100对根尖组织进行处理；⑤简化了实验步骤。改良之后的方法缩短了整个实验过程，96孔板的使用可以使多个平行实验同时进行，吹洗更加彻底，实验操作方便快捷，处理效果得到优化。
本研究对水稻根尖细胞中蛋白定位的三种方法进行了比较，结果表明，改进后的实验方案使水稻根尖细胞中目的蛋白PIN2的定位清晰可见，并且实验步骤简化，操作方便快速，提高了实验效率。PIN2作为生长素的外排蛋白，其研究对于探究根发育的分子机制及推进作物生长发育的优化改良有重大意义，同时，为其它参与内吞作用的蛋白的定位提供了较好的方法，有助于深入研究内吞作用的机制。
由于操作步骤简化，改良的免疫荧光定位法存在一定的缺陷，如仍存在有多余非特异信号等，分析其原因可能是与相应抗原发生了交叉反应，因此本方案仍需要进一步的改进研究。
参 考 文 献：
[1] Glweiler L， Guan C， Müller A， et al. Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue[J]. Science， 1998， 282（5397）： 2226 -2230.
[2] Wisniewska J， Xu J， Seifertova D， et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants[J]. Science， 2006， 312（5775）： 883.
[3] Grieneisen V A， Xu J， Marée A F， et al. Auxin transport is sufficient to generate a maximum and gradient guiding root growth[J]. Nature， 2007， 449 （7165）： 1008 -1013.
[4] Paciorek T， Zazímalová E， Ruthardt N， et al. Auxin inhibits endocytosis and promotes its own efflux from cells[J]. Nature， 2005， 435（7046）： 1251-1256.
[5] Pan J W， Fujioka S， Peng J L， et al. The E3 ubiquitin ligase SCF TIR1/AFB and membrane sterols play key roles in auxin regulation of endocytosis， recycling， and plasma membrane accumulation of the auxin efflux transporter PIN2 in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell， 2009， 21（2）： 568-580. [6] 潘建伟， 叶晓帆， 王超， 等. 拟南芥PIN2介导的生长素极性运输调控植物根向地性[J]. 浙江师范大学学报：自然科学版， 2010， 33 （1）： 1-6.
[7] Chen R， Hilson P， Sedbrook J， et al. The Arabidopsis thaliana AGRAVITROPIC 1 gene encodes a component of the polar- auxin- transport efflux carrier [J]. PNAS， 1998， 95（25）： 15112-15117.
[8] 石江华， 廖红， 严小龙. 植物根系向地性感应的分子机理与养分吸收 [J]. 植物学通报， 2005， 22（5）： 523-531.
[9] Brandizzi F， Fricker M，Hawes C. A greener world： the revolution in plant bioimaging [J]. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.， 2002，3（7）：520 -530.
[10]Lauber M H， Waizengger I，Steinmann T，et al. The Arabidopsis KNOLLE protein is a cytokinesis-specific syntaxin [J]. J. Cell Biol.，1997，139：1485-1493.
[11]Friml J，Benková E， Mayer U，et al. Automated wholemount localization techniques for plant seedlings [J]. Plant J.， 2003，34：115-124.
[12]Sauer M，Paciorek T，Benková E，et al. Immunocytochemical techniques for whole-mount in situprotein localization in plants [J]. Nature Protocols， 2006， 1 （1）： 98-103.
[13]Ma J F， Takahashi E. Soil， fertilizer and plant silicon research in Japan [M]. Elsevier，2002.