论文部分内容阅读
摘要：目的 从双丹明目胶囊24个入血成分中筛选出抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的有效成分。方法 将双丹明目胶囊24个入血成分标准品均稀释成终浓度为1、10、100 μg/mL的溶液，分别干预体外培养的HUVEC，采用MTT法检测细胞存活率，对各成分进行初筛，再对有效成分进行浓度细化，确定有效成分的最佳作用浓度。在此基础上，采用Hoechst33258荧光染色和流式细胞术检测各有效成分对HUVEC凋亡的影响。结果 MTT检测结果显示，双丹明目胶囊24个入血成分中4个成分能有效抑制HUVEC增殖（P<0.05），分别为3-乙酸齐墩果酸、丹参酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷，其最佳作用浓度分别为75、75、50、75 μg/mL;进一步研究发现，上述4个成分均能使HUVEC细胞核固缩、碎裂，数量减少，细胞凋亡率显著增加（P<0.05），其中以丹参酮ⅡA和芹菜素效果尤为明显。结论 3-乙酸齐墩果酸、丹参酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷是双丹明目胶囊抑制HUVEC增殖、发挥治疗糖尿病视网膜病变疗效的有效成分。
关键词：双丹明目胶囊;人脐静脉内皮细胞;增殖;有效成分筛选;芹菜素;丹参酮ⅡA
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）07-0048-04
Abstract： Objective To screen out the effective components inhibiting the proliferation of human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） from 24 blood components of Shuangdan Mingmu Capsules. Methods All the 24 standards were diluted to a final concentration of 1， 10， and 100 μg/mL， and the HUVEC were cultured in vitro. The cell proliferation inhibition rate was measured by MTT method， and the components were screened. Concentration refinement was used to determine the optimal concentration of effective components. Hoechst33258 fluorescence staining and flow cytometry were used to detect the effects of various effective components on apoptosis of HUVEC. Results The results of MTT experiment showed that among the 24 blood components of Shuangdan Mingmu Capsules， 4 components could effectively inhibit the proliferation of HUVEC （P<0.05）， that were 3-acetate oleanolic acid， tanshinone ⅡA， apigenin and cosmosin， and the optimal concentrations were 75， 75， 50， and 75 μg/mL， respectively. Further studies found that the above four components could make the nucleus of HUVEC pyknosis， fragmentation， number decreased， and the apoptotic rate increased significantly （P<0.05）， especially the effect of tanshinone ⅡA and apigenin. Conclusion 3-acetyl oleanolic acid， tanshinone ⅡA， apigenin and cosmosin are effective components of Shuangdan Mingmu Capsules for inhibiting the proliferation of HUVEC and treating diabetic retinopathy.
Keywords： Shuangdan Mingmu Capsules; HUVEC; proliferation; screening of effective components; apigenin; tanshinone ⅡA
視网膜病变是糖尿病最严重的微血管并发症之一，发病率高且危害性大，目前尚缺乏有效药物能完全控制其发生发展。双丹明目胶囊主治肝肾阴虚、瘀血阻络所致的糖尿病视网膜病变。前期临床和基础研究均表明，双丹明目胶囊能有效改善糖尿病视网膜病变疾病下血糖血脂紊乱，纠正血液流变异常状态，降低血管内皮生长因子（VEGF）表达，抑制新血管生成[1-3]。在此基础上，本课题组对双丹明目胶囊药效物质基础进行了研究，共从该复方中鉴定出102个化学成分及24个主要的入血成分[4-5]。而其中究竟哪些成分发挥着抑制内皮细胞增殖，进而抑制微血管生成的功效，尚未明确。本研究在前期基础上，以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为研究对象，通过采用不同浓度的24个入血成分标准品进行干预，筛选出双丹明目胶囊的有效成分及作用浓度，以期为明确其药效物质基础、确定质量控制标准、阐明体内作用机制奠定基础。 1 材料与方法
1.1 药物和细胞株
所有标准品均购自中国食品药品检定研究院，于使用前用甲醇溶解，并用培养基稀释成所需浓度。HUVEC购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.2 主要试剂与仪器
RPMI1640培养基、胎牛血清、胰酶，美国Gibco公司;MTT粉末，上海碧云天生物技术研究所。CO2培养箱、MK3型酶标仪，美国Thermo公司;5417R低温高速离心机，德国Eppendorf公司;高内涵细胞成像系统，美国PerkinElmer公司;流式细胞仪，美国BD公司。
1.3 细胞培养
HUVEC用含10%胎牛血清RPMI1640培养基，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养，每隔2～3 d胰酶消化并传代，定时更换培养液。
1.4 MTT法检测细胞存活率
细胞经胰酶消化，调整细胞浓度，8000个/孔接种于96孔板，待细胞完全贴壁后，弃去培养液。配制不同终浓度待测组分溶液，药物组每孔加100 μL，同时设置空白组（调零组）和对照组，空白组除不加细胞悬液外其余同药物组，对照组每孔加100 μL培养基，每组设6个复孔。培养箱中继续培养24 h后，加入MTT液，避光孵育4 h后，每孔加入DMSO液150 μL，室温振荡10 min，于酶标仪450 nm波长处测定各孔吸光度（A），计算细胞存活率[（A药物组-A空白组）÷（A对照组-A空白组）]，以每板对照组细胞存活率为1。
1.5 Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡形态
细胞经胰酶消化后，调整细胞浓度，8000个/孔接种于96孔板，待细胞完全贴壁后，弃去培养液。加入药物干预24 h后，取出96孔板，弃去培养液，加入PBS洗涤3次，然后每孔加入Hoechst33258染液100 μL，37 ℃避光孵育30 min;孵育完成后，弃去孔内染液，PBS洗2次，采用高内涵细胞成像系统检测细胞凋亡。
1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率
药物干预完成后，消化HUVEC，每组细胞数为1×106个/mL，1000 r/min离心5 min，去除上层液体，加入PBS洗涤2次。加入适量Annexin V-FITC/PI溶液5 μL，4 ℃孵育30 min，流式细胞仪上机检测，采用Cell Quest软件分析细胞凋亡率。
1.7 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较用方差分析。α=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 双丹明目胶囊各入血成分对人脐静脉内皮细胞存活率的影响
对双丹明目胶囊24个入血成分进行筛选发现，3-乙酸齐墩果酸、丹参酮ⅡA、芹菜素、大波斯菊苷能有效抑制HUVEC增殖，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），而同来源于丹参中的隐丹参酮和柳杉酚则有明显促进HUVEC增殖的作用，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 双丹明目胶囊抑制HUVEC增殖有效成分的最佳浓度
对能明显抑制HUVEC增殖的4个有效成分进行浓度细化，发现各成分对HUVEC增殖的抑制作用与初筛结果一致，根据梯度浓度下不同有效成分的细胞存活率，确定4个有效成分最佳作用浓度，3-乙酸齐墩果酸为75 μg/mL，丹参酮ⅡA为75 μg/mL，芹菜素为50 μg/mL，大波斯菊苷为75 μg/mL。见表2。
2.3 双丹明目胶囊有效成分对HUVEC凋亡形态的影响
Hoechst33258荧光染色结果显示，对照组HUVEC细胞排列整齐，形态正常，分布均匀，荧光呈暗蓝色，无明显的凋亡特征;经双丹明目胶囊中有效成分3-乙酸齐墩果酸、丹参酮ⅡA、芹菜素及大波斯菊苷干预后，同一视野下细胞数目明显减少，细胞分布散乱，部分细胞核碎裂，呈透亮状，呈现典型的凋亡形态学特征。见图1。
2.4 双丹明目胶囊有效成分对HUVEC凋亡率影响
对照组HUVEC凋亡率仅为0.97%，双丹明目胶囊各有效成分干预后，细胞凋亡率均显著上升，差异有统计学意义（P<0.01）。其中，丹参酮ⅡA和芹菜素诱导HUVEC凋亡能力明显更强，平均凋亡率分别为26.63%、28.31%。见图2、表3。
3 讨论
双丹明目胶囊是基于糖尿病视网膜病变之“肝肾阴虚、瘀血阻络”病机而成方，由女贞子、墨旱莲、丹参、三七、山萸肉、山药、牡丹皮、茯苓、红土茯苓、泽泻、牛膝11味中药组成。方中女贞子、墨旱莲滋补肝肾、明目，为君药;丹参、三七活血养血、化瘀通络，山萸肉、山药补肾养肝、健脾固精，四者共为臣药;牡丹皮、茯苓、红土茯苓、泽泻清肝泻火、利水消肿，共为佐药;牛膝活血逐瘀、强筋壮骨且性善下行，可防血气上逆，为使药。诸药合用，共奏益肾养肝、活血明目之功效。
抑制视网膜新生血管生成是治疗糖尿病视网膜病变的关键，血管内皮细胞增殖、芽生、游走又是血管新生的基础[6]。HUVEC来源于人脐静脉，是一种具有干细胞潜能的内皮细胞，抑制HUVEC增殖意味着能减少或阻止新血管的生成，从而能改善糖尿病并发的视网膜、心血管病变等[7]。通过对双丹明目胶囊24个入血成分文献调研发现，仅有芹菜素被报道抑制HUVEC增殖的作用[8-9]。本研究每个成分标准品均配制成低、中、高3个浓度，经MTT检测反复筛選，确定3-乙酸齐墩果酸、丹参酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷4个成分有明显抑制HUVEC增殖作用，然后对各个成分进行多浓度摸索，确定了4个有效成分抑制HUVEC增殖的最佳作用浓度。此外，通过Hoechst染色和流式细胞术检测细胞凋亡发现，上述4个成分均能诱使HUVEC呈凋亡形态，增加其凋亡率，并以丹参酮ⅡA和芹菜素抑制效果最为明显。 综上，本研究确定3-乙酸齐墩果酸、丹参酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷是双丹明目胶囊发挥治疗糖尿病视网膜病变功效的有效成分，其中3-乙酸齐墩果酸和芹菜素来自君药墨旱莲，大波斯菊苷来自君药女贞子，丹参酮ⅡA则来自臣药丹参。本研究确定了双丹明目胶囊药效成分，为其质量控制研究提供了依据。
参考文献：
[1] 涂良钰，王文長，王育良，等.双丹明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变的临床研究[J].中国新药杂志，2009，24（12）：2331-2336.
[2] 符超君，凌艳君，颜家朝，等.双丹明目胶囊对糖尿病视网膜病变大鼠血糖血脂及血液流变学的影响[J].湖南中医药大学学报，2018，38（5）：489-492.
[3] 符超君，凌艳君，颜家朝，等.双丹明目胶囊对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜组织低氧诱导因子-1α和核因子-κB表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2018，25（6）：44-47.
[4] 龙红萍，秦裕辉，刘峥嵘，等.UPLC-Q-TOF法分析双丹明目胶囊化学成分[J].中成药，2017，39（7）：1527-1531.
[5] 龙红萍，秦裕辉，刘峥嵘，等.UPLC-Q-TOF-MS法分析双丹明目胶囊入血成分[J].中成药，2017，39（10）：2204-2206.
[6] WANG J J， ZHU M， LE Y Z. Functions of Müller cell-derived vascular endothelial growth factor in diabetic retinopathy[J]. World J Diabetes，2015，6（5）：726-733.
[7] ZHOU Y， YUAN J， QI C， et al. Calcium dobesilate may alleviate diabetes-induced endothelial dysfunction and inflammation[J]. Mol Med Rep，2017，16（6）：8635-8642.
[8] SAHIN M， SAHIN E， G?M??L? S. Effects of lycopene and apigenin on human umbilical vein endothelial cells in vitro under angiogenic stimulation[J]. Acta Histochem，2012，114（2）：94-100.
[9] ZOU Y， CHIOU G C. Apigenin inhibits laser-induced choroidal neovascularization and regulates endothelial cell function[J]. J Ocul Pharmacol Ther，2006，22（6）：425-430.
关键词：双丹明目胶囊;人脐静脉内皮细胞;增殖;有效成分筛选;芹菜素;丹参酮ⅡA
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）07-0048-04
Abstract： Objective To screen out the effective components inhibiting the proliferation of human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） from 24 blood components of Shuangdan Mingmu Capsules. Methods All the 24 standards were diluted to a final concentration of 1， 10， and 100 μg/mL， and the HUVEC were cultured in vitro. The cell proliferation inhibition rate was measured by MTT method， and the components were screened. Concentration refinement was used to determine the optimal concentration of effective components. Hoechst33258 fluorescence staining and flow cytometry were used to detect the effects of various effective components on apoptosis of HUVEC. Results The results of MTT experiment showed that among the 24 blood components of Shuangdan Mingmu Capsules， 4 components could effectively inhibit the proliferation of HUVEC （P<0.05）， that were 3-acetate oleanolic acid， tanshinone ⅡA， apigenin and cosmosin， and the optimal concentrations were 75， 75， 50， and 75 μg/mL， respectively. Further studies found that the above four components could make the nucleus of HUVEC pyknosis， fragmentation， number decreased， and the apoptotic rate increased significantly （P<0.05）， especially the effect of tanshinone ⅡA and apigenin. Conclusion 3-acetyl oleanolic acid， tanshinone ⅡA， apigenin and cosmosin are effective components of Shuangdan Mingmu Capsules for inhibiting the proliferation of HUVEC and treating diabetic retinopathy.
Keywords： Shuangdan Mingmu Capsules; HUVEC; proliferation; screening of effective components; apigenin; tanshinone ⅡA
視网膜病变是糖尿病最严重的微血管并发症之一，发病率高且危害性大，目前尚缺乏有效药物能完全控制其发生发展。双丹明目胶囊主治肝肾阴虚、瘀血阻络所致的糖尿病视网膜病变。前期临床和基础研究均表明，双丹明目胶囊能有效改善糖尿病视网膜病变疾病下血糖血脂紊乱，纠正血液流变异常状态，降低血管内皮生长因子（VEGF）表达，抑制新血管生成[1-3]。在此基础上，本课题组对双丹明目胶囊药效物质基础进行了研究，共从该复方中鉴定出102个化学成分及24个主要的入血成分[4-5]。而其中究竟哪些成分发挥着抑制内皮细胞增殖，进而抑制微血管生成的功效，尚未明确。本研究在前期基础上，以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为研究对象，通过采用不同浓度的24个入血成分标准品进行干预，筛选出双丹明目胶囊的有效成分及作用浓度，以期为明确其药效物质基础、确定质量控制标准、阐明体内作用机制奠定基础。 1 材料与方法
1.1 药物和细胞株
所有标准品均购自中国食品药品检定研究院，于使用前用甲醇溶解，并用培养基稀释成所需浓度。HUVEC购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.2 主要试剂与仪器
RPMI1640培养基、胎牛血清、胰酶，美国Gibco公司;MTT粉末，上海碧云天生物技术研究所。CO2培养箱、MK3型酶标仪，美国Thermo公司;5417R低温高速离心机，德国Eppendorf公司;高内涵细胞成像系统，美国PerkinElmer公司;流式细胞仪，美国BD公司。
1.3 细胞培养
HUVEC用含10%胎牛血清RPMI1640培养基，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养，每隔2～3 d胰酶消化并传代，定时更换培养液。
1.4 MTT法检测细胞存活率
细胞经胰酶消化，调整细胞浓度，8000个/孔接种于96孔板，待细胞完全贴壁后，弃去培养液。配制不同终浓度待测组分溶液，药物组每孔加100 μL，同时设置空白组（调零组）和对照组，空白组除不加细胞悬液外其余同药物组，对照组每孔加100 μL培养基，每组设6个复孔。培养箱中继续培养24 h后，加入MTT液，避光孵育4 h后，每孔加入DMSO液150 μL，室温振荡10 min，于酶标仪450 nm波长处测定各孔吸光度（A），计算细胞存活率[（A药物组-A空白组）÷（A对照组-A空白组）]，以每板对照组细胞存活率为1。
1.5 Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡形态
细胞经胰酶消化后，调整细胞浓度，8000个/孔接种于96孔板，待细胞完全贴壁后，弃去培养液。加入药物干预24 h后，取出96孔板，弃去培养液，加入PBS洗涤3次，然后每孔加入Hoechst33258染液100 μL，37 ℃避光孵育30 min;孵育完成后，弃去孔内染液，PBS洗2次，采用高内涵细胞成像系统检测细胞凋亡。
1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率
药物干预完成后，消化HUVEC，每组细胞数为1×106个/mL，1000 r/min离心5 min，去除上层液体，加入PBS洗涤2次。加入适量Annexin V-FITC/PI溶液5 μL，4 ℃孵育30 min，流式细胞仪上机检测，采用Cell Quest软件分析细胞凋亡率。
1.7 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较用方差分析。α=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 双丹明目胶囊各入血成分对人脐静脉内皮细胞存活率的影响
对双丹明目胶囊24个入血成分进行筛选发现，3-乙酸齐墩果酸、丹参酮ⅡA、芹菜素、大波斯菊苷能有效抑制HUVEC增殖，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），而同来源于丹参中的隐丹参酮和柳杉酚则有明显促进HUVEC增殖的作用，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 双丹明目胶囊抑制HUVEC增殖有效成分的最佳浓度
对能明显抑制HUVEC增殖的4个有效成分进行浓度细化，发现各成分对HUVEC增殖的抑制作用与初筛结果一致，根据梯度浓度下不同有效成分的细胞存活率，确定4个有效成分最佳作用浓度，3-乙酸齐墩果酸为75 μg/mL，丹参酮ⅡA为75 μg/mL，芹菜素为50 μg/mL，大波斯菊苷为75 μg/mL。见表2。
2.3 双丹明目胶囊有效成分对HUVEC凋亡形态的影响
Hoechst33258荧光染色结果显示，对照组HUVEC细胞排列整齐，形态正常，分布均匀，荧光呈暗蓝色，无明显的凋亡特征;经双丹明目胶囊中有效成分3-乙酸齐墩果酸、丹参酮ⅡA、芹菜素及大波斯菊苷干预后，同一视野下细胞数目明显减少，细胞分布散乱，部分细胞核碎裂，呈透亮状，呈现典型的凋亡形态学特征。见图1。
2.4 双丹明目胶囊有效成分对HUVEC凋亡率影响
对照组HUVEC凋亡率仅为0.97%，双丹明目胶囊各有效成分干预后，细胞凋亡率均显著上升，差异有统计学意义（P<0.01）。其中，丹参酮ⅡA和芹菜素诱导HUVEC凋亡能力明显更强，平均凋亡率分别为26.63%、28.31%。见图2、表3。
3 讨论
双丹明目胶囊是基于糖尿病视网膜病变之“肝肾阴虚、瘀血阻络”病机而成方，由女贞子、墨旱莲、丹参、三七、山萸肉、山药、牡丹皮、茯苓、红土茯苓、泽泻、牛膝11味中药组成。方中女贞子、墨旱莲滋补肝肾、明目，为君药;丹参、三七活血养血、化瘀通络，山萸肉、山药补肾养肝、健脾固精，四者共为臣药;牡丹皮、茯苓、红土茯苓、泽泻清肝泻火、利水消肿，共为佐药;牛膝活血逐瘀、强筋壮骨且性善下行，可防血气上逆，为使药。诸药合用，共奏益肾养肝、活血明目之功效。
抑制视网膜新生血管生成是治疗糖尿病视网膜病变的关键，血管内皮细胞增殖、芽生、游走又是血管新生的基础[6]。HUVEC来源于人脐静脉，是一种具有干细胞潜能的内皮细胞，抑制HUVEC增殖意味着能减少或阻止新血管的生成，从而能改善糖尿病并发的视网膜、心血管病变等[7]。通过对双丹明目胶囊24个入血成分文献调研发现，仅有芹菜素被报道抑制HUVEC增殖的作用[8-9]。本研究每个成分标准品均配制成低、中、高3个浓度，经MTT检测反复筛選，确定3-乙酸齐墩果酸、丹参酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷4个成分有明显抑制HUVEC增殖作用，然后对各个成分进行多浓度摸索，确定了4个有效成分抑制HUVEC增殖的最佳作用浓度。此外，通过Hoechst染色和流式细胞术检测细胞凋亡发现，上述4个成分均能诱使HUVEC呈凋亡形态，增加其凋亡率，并以丹参酮ⅡA和芹菜素抑制效果最为明显。 综上，本研究确定3-乙酸齐墩果酸、丹参酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷是双丹明目胶囊发挥治疗糖尿病视网膜病变功效的有效成分，其中3-乙酸齐墩果酸和芹菜素来自君药墨旱莲，大波斯菊苷来自君药女贞子，丹参酮ⅡA则来自臣药丹参。本研究确定了双丹明目胶囊药效成分，为其质量控制研究提供了依据。
参考文献：
[1] 涂良钰，王文長，王育良，等.双丹明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变的临床研究[J].中国新药杂志，2009，24（12）：2331-2336.
[2] 符超君，凌艳君，颜家朝，等.双丹明目胶囊对糖尿病视网膜病变大鼠血糖血脂及血液流变学的影响[J].湖南中医药大学学报，2018，38（5）：489-492.
[3] 符超君，凌艳君，颜家朝，等.双丹明目胶囊对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜组织低氧诱导因子-1α和核因子-κB表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2018，25（6）：44-47.
[4] 龙红萍，秦裕辉，刘峥嵘，等.UPLC-Q-TOF法分析双丹明目胶囊化学成分[J].中成药，2017，39（7）：1527-1531.
[5] 龙红萍，秦裕辉，刘峥嵘，等.UPLC-Q-TOF-MS法分析双丹明目胶囊入血成分[J].中成药，2017，39（10）：2204-2206.
[6] WANG J J， ZHU M， LE Y Z. Functions of Müller cell-derived vascular endothelial growth factor in diabetic retinopathy[J]. World J Diabetes，2015，6（5）：726-733.
[7] ZHOU Y， YUAN J， QI C， et al. Calcium dobesilate may alleviate diabetes-induced endothelial dysfunction and inflammation[J]. Mol Med Rep，2017，16（6）：8635-8642.
[8] SAHIN M， SAHIN E， G?M??L? S. Effects of lycopene and apigenin on human umbilical vein endothelial cells in vitro under angiogenic stimulation[J]. Acta Histochem，2012，114（2）：94-100.
[9] ZOU Y， CHIOU G C. Apigenin inhibits laser-induced choroidal neovascularization and regulates endothelial cell function[J]. J Ocul Pharmacol Ther，2006，22（6）：425-430.