研究Shh/Bmp4信号通路基因甲基化修饰对肛门直肠畸形(anorectal malformation,ARM)胎鼠末端直肠神经系统(enteric nervous system,ENS)发育的影响。
方法SD孕鼠15只,按照数字表法随机分成模型组(ETU)、干预组(ETU+5-azaC)与正常组(NC)。孕10 d,ETU组和ETU+5-azaC组均经胃管注入乙烯硫脲,ETU+5-azaC组同时腹腔注射5-azaC(3 mg/kg)。孕20 d,剖宫取子鼠。观察ARM发生率,用PCR、免疫组化和Western blot等方法检测子鼠末端直肠组织中DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)含量及活性、Shh基因启动子区甲基化状态及Shh/Bmp4信号通路关键组分的表达水平。
结果①ETU组和ETU+5-azaC组的ARM发生率分别为98.3%、64.9%,两组之间差异有统计学意义(P<0.0001);②ETU组和ETU+5-azaC组末端直肠组织中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的表达水平较对照组均明显升高(P<0.01);ETU组DNMT1、DNMT3a的表达水平较ETU+5-azaC组明显升高(P<0.01),而两组DNMT3b表达水平未发现明显差异;③ETU组末端直肠组织中Shh启动子区甲基化水平明显高于ETU+5-azaC组和对照组(P<0.05),ETU+5-azaC组亦较对照组明显升高(P=0.05);④ETU组和ETU+5-azaC组末端直肠组织中Shh和Bmp4表达水平较对照组均明显降低(P<0.0001),同时ETU组较ETU+5-azaC组间相比Shh和Bmp4表达水平亦降低(P<0.05);⑤ETU组直肠组织中S100标记的黏膜下层、肌间神经丛明显较正常组表达减少(P<0.0001),ETU+5-azaC组与ETU组相比差异有统计学意义(P<0.0001);ETU组和ETU+5-azaC组直肠中c-kit标记的cajal间质细胞和NSE标记的神经节细胞未见明显表达。
结论ARM大鼠模型直肠末端组织甲基化状态可通过干预发生变化,Shh基因低甲基化可促使Shh/Bmp4通路关键组分表达上调,S-100标记的神经丛数量明显增多,可能介导直肠ENS的发育。