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【摘要】 微小RNA（microRNA ）是一类高度保守的非编码小RNA。它通过降解miRNA或抑制蛋白质翻译而调控基因的表达。最新研究表明，microRNA 在心血管病理、生理过程中起者十分重要的调控作用。它参与了心脏发育、心脏重构、心律失常、血管病变等过程。现就microRNA的生物发生、作用机制及其在心肌肥厚、心力衰竭、心肌损伤、凋亡、心律失常、血管病变中相关作用的研究进展作一综述。
【关键词】 microRNA；心肌肥厚；心肌损伤；凋亡；心律失常
microRNA（miRNA）是一类在生物进化过程中高度保守的非编码小分子 RNA，通过识别靶基因mRNA分子3＇末端翻译区域特异性结合, 负性调控靶mRNA翻译，是一类非常重要的转录后调控因子，在心血管疾病发生发展过程中起到十分重要的调控作用。近年来在研究miRNA在心肌肥厚、心力衰竭、心肌损伤、凋亡、心律失常、血管病变等疾病的作用机制方面取得了一系列进展，使其成为国际心血管研究领域的热点。
1 microRNA生成及其作用机制
1.1 microRNA生成 1993年Lee等在秀丽新小杆线虫(Cae2norhabditis elegans )中发现了第一个 miRNA,并命名为lin-4。2000年Reinhart等在对线虫发育调控研究中发现了let-7,从而拉开了miRNA研究的序幕。在细胞核内编码miRNA的基因通过RNA聚合酶Ⅱ的作用转录生成 miRNA的原始转录产物pri-miRNA , pri-miRNA在双链RNA特异的核酸酶-Drosha酶的作用下, 被剪切为长约 70-90个核苷酸长度具有发夹型结构的前体miRNA( pre-miRNA )。pre-miRNA在 Ran-GTP 和转运蛋白 Exportin 5的协同作用下转运到胞浆中，并在Dicer酶的作用下被剪切成 21-25个核苷酸的双链mi-RNA。随后双链解旋, 其中一条链被降解，另一条则成为成熟miRNA。成熟miRNA以不对称方式整合入RNA诱导的基因沉默复合物（RISC）后形成miRNA复合物（miRISC）。如果miRNA与靶mRNA互补配对后则该复合物降解靶mRNA。若miRNA与靶mRNA不完全互补，则起到封闭mRNA的作用，抑制其翻译过程。
1.2 microRNA作用机制 研究表明人类基因组中约有30%基因受miRNA调控，miRNA具有广泛的基因调节功能。每个miRNA可以有多个靶基因 ,而几个 miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达，提示miRNA可能通过多元化途径调控靶基因表达。microRNA之间还可能存在协同、拮抗等相互作用，从而表现出microRNA功能作用多样性。但是在不同的组织中，都有特异的miRNA占主导地位。
2 microRNA检测方法
目前miRNA常用检测方法有：（1）Northern blotting 法：是经典的探针杂交检测法，但特异性和灵敏度不高，只能检测表达量非常大的microRNAs而且不能定量检测，为此发展了用锁核酸(LNA)修饰的杂交探针来取代传统DNA探针技术,使Northern blotting法的检测灵敏度和特异性得到显著改善；（2）实时荧光定量 PCR法(Real-time PCR)：用于基因表达的定量和用 DNA阵列技术检测证实基因的差异表达。具有敏感性高、可定量检测样本，需要量少等优点；（3）微阵列芯片技术(Microarray)：能够同时测定多个样本, 可以实现 miRNA 的高通量分析, 即在一块芯片上同时固定多个与miRNA序列互补的探针, 然后加入经过标记的样本RNA, 杂交后进行信号检测，但需要用其它方法对其结果进行检验。
3 microRNA與心血管疾病
越来越多研究发现 miRNA在生物发育过程中存在组织特异性表达, 参与形成并维持组织特异性。先后有数十种miRNA在心肌细胞中被鉴定，例如miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-133b、miRNA-195等，它们在心血管系统疾病发生发展过程中起着非常重要的作用。
3.1 microRNA与心肌肥厚及心力衰竭 miRNA是心肌细胞异常增殖生的潜在抑制物或加速剂。特定miRNA表达上调, 抑制心肌细胞异常增殖从而阻止或延缓心脏重构的进程；表达下调, 促进心肌细胞异常增殖, 加速心脏重构。目前已经明确心肌细胞肥大中发挥作用的miRNA主要有miRNA-1、miRNA-133、 miRNA-208、miRNA-195、miRNA-21。
miRNA-208是一种心脏组织特异性表达的miRNA，主要在心脏表达，但在肺脏也有微量表达，在心肌细胞增殖、 纤维化及调节β-心肌肌球蛋白链 (β-myosin heavy chain , β- MHC)表达中发挥作用。miRNA-208由α-心肌肌球蛋白链 (α-myosin heavy chain , α- MHC)基因的27位内含子编码, 后者可以促进心脏收缩蛋白的生成, 调节心肌增生。Thomas E. Callis等人在体内通过调控α- MHC的启动子使 miRNA-208a 过度表达时，心脏出现肥大。在体外使分离的心肌细胞中α- MHC过度表达后，心肌细胞变大。Van Rooij等[1]研究发现miRNA-208可能通过抑制靶基因甲状腺素受体相关蛋白1( THRAP1)而调控β- MHC的表达,发挥抗心肌肥厚、 纤维化和心力衰竭的作用。
3.2 microRNA与心肌损伤、心肌凋亡 Yin[2]等研究发现缺血预适应（IPC）处理后miRNA-1、miRNA-21和miRNA-24明显增加，机制类似于延迟缺血预适应，可能是通过上调内皮一氧化氮合酶、热休克蛋白（HSP70）以及热休克基因转录因子1发挥作用。进一步的研究发现小鼠经热休克处理后miRNA-1、miRNA-21和miRNA-24在心脏中显著增高，将分离出的miRNA给非热休克（HS）处理的小鼠注射，促凋亡基因被抑制而抗凋亡基因表达增加，缺血-再灌注损伤后的梗死面积显著减少，说明miRNA在缺血-再灌注损伤中发挥保护作用。
3.3 microRNA与心律失常 心肌细胞内离子通道功能异常可导致心脏冲动的形成或传导异常，从而诱发心律失常。新近研究表明有些心律失常可能与miRNA-1和miRNA133的表达异常有关。MiRNA-1和miRNA-133通过抑制靶基因HCN2/HCN4（超极化激活环化核苷酸调控阳离子通道基因）的表达和功能进而抑制了传导，引起心律失常；并且miRNA-1还可能通过下调KCNJ2和GJA1的表达，KCNJ2编码Kir2.1是负责调节心肌静息膜电位的主要钾离子通道亚单位，GJA1负责心室肌细胞之间的电耦联，故减慢心肌细胞传导和复极化，从而引起QRS波时程延长，Q-T间期延长；或抑制PP2A调节亚基B56α，导致依赖CaMKⅡ的RyR2过度磷酸化，进而促进肌浆网Ca2+释放，导致心律失常。Yang等[3]研究发现miRNA-1在冠状动脉性心脏病患者以及大鼠心梗模型的心脏中表达均明显上调。通过在梗死区域心肌内特异上调或下调miRNA-1的表达发现，miRNA-1的过表达可加重心律失常的发生而人为下调miRNA-1的表达则减轻心梗后心律失常的发生。进一步研究表明，心肌梗死后miRNA-1的过度表达抑制了靶基因KCNJ2（编码钾离子通道主要亚基Kir2.1）和GJA1（编码缝隙连接蛋白Cx43）的表达而引发心律失常。
快速激活延迟整流钾电流（Ikr）是人类心肌细胞动作电位3期快速复极的主要电流，它由延迟整流钾通道蛋白介导。研究表明，在兔糖尿病性心脏病时，miRNA-133在心肌表达上调，在转录后水平抑制ERG（Ether-a-Go-Go-相关基因）表达，使3相复极延长，从而导致QT间期延长。miRNA-133有望成为治疗LQTS的新靶点。
3.4 microRNA与血管内膜病变 血管内膜新生是动脉粥样硬化、再狭窄病变和高血压的共同病理基础。有人采用大鼠颈动脉球囊损伤模型观察了血管损伤后miRNA的变化规律，发现球囊损伤后血管组织中miRNA-21表达显著上调。继而采用反义寡核苷酸敲除miRNA-21可抑制颈动脉内膜球囊损伤后的血管内膜增生。进一步研究发现miRNA-21通过作用于PTEN、Bcl-2基因而抑制血管平滑肌细胞的增殖效應。这些发现有望解决支架术后、冠状动脉搭桥后、心脏移植后等血管再狭窄问题。
4 microRNA在相关治疗中的应用
运用RNA干扰治疗疾病的研究正在全世界开展。早在2004年，Soutsche就成功运用siRNA（小干扰RNA）沉默了小鼠内源性载脂蛋白B（apoB）的表达使总胆固醇的水平明显下降。Yang等[3]通过向小鼠梗死心肌注射经过脂质体预处理miRNA-1的2-氧-甲基修饰反义寡核苷酸特异下调了梗死心肌miRNA-1的表达，从而降低了心梗后心律失常的发生。Bonauer等研究发现,在肢体缺血及心肌梗死的小鼠模型中, 抑制miRNA- 92a的表达能增加血管形成,促进缺血受损组织的功能恢复。由此可见,如果这些方法安全有效的应用于人体，将大大促进疾病治疗技术的发展。
5 展望
miRNAs研究开辟了一个新的领域，即在基因水平诊断和治疗心血管疾病。当然，目前还存在诸多要解决的问题，如miRNA-1在哪种心血管疾病中表达增高？哪种应激信号增加miRNA-1表达，哪种应激信号减少miRNA-1表达？梗死或肥大后残存心肌组织的差别是什么？在心肌梗死或其他形式器质性心脏病发生后，降低miRNA-1活性能否减少心肌肥厚、改善机械功能并延长生命？总之，未来世界是RNA的世界，它将是生命科学领域里新的研究热点。
参考文献
[1] Van Rooij E , Sutherland LB, Q i X, et al.Control of stress-dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA [J]. Science , 2007 , 316( 5824): 575 -579 .
[2] Yin C, Salloum FN, Kukreja RC.A novel role of endothelial nitric oxide synthase an heat shock protein 70[J].Circ Res,2009,104(5):572-575.
[3] Yang B,Lin H ,Xiao J,et al.The muscle-specific microRNA miRNA-1 regulates cardiac arrhyhmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2[J]. Nat Med , 2007,13(4):486-491.
【关键词】 microRNA；心肌肥厚；心肌损伤；凋亡；心律失常
microRNA（miRNA）是一类在生物进化过程中高度保守的非编码小分子 RNA，通过识别靶基因mRNA分子3＇末端翻译区域特异性结合, 负性调控靶mRNA翻译，是一类非常重要的转录后调控因子，在心血管疾病发生发展过程中起到十分重要的调控作用。近年来在研究miRNA在心肌肥厚、心力衰竭、心肌损伤、凋亡、心律失常、血管病变等疾病的作用机制方面取得了一系列进展，使其成为国际心血管研究领域的热点。
1 microRNA生成及其作用机制
1.1 microRNA生成 1993年Lee等在秀丽新小杆线虫(Cae2norhabditis elegans )中发现了第一个 miRNA,并命名为lin-4。2000年Reinhart等在对线虫发育调控研究中发现了let-7,从而拉开了miRNA研究的序幕。在细胞核内编码miRNA的基因通过RNA聚合酶Ⅱ的作用转录生成 miRNA的原始转录产物pri-miRNA , pri-miRNA在双链RNA特异的核酸酶-Drosha酶的作用下, 被剪切为长约 70-90个核苷酸长度具有发夹型结构的前体miRNA( pre-miRNA )。pre-miRNA在 Ran-GTP 和转运蛋白 Exportin 5的协同作用下转运到胞浆中，并在Dicer酶的作用下被剪切成 21-25个核苷酸的双链mi-RNA。随后双链解旋, 其中一条链被降解，另一条则成为成熟miRNA。成熟miRNA以不对称方式整合入RNA诱导的基因沉默复合物（RISC）后形成miRNA复合物（miRISC）。如果miRNA与靶mRNA互补配对后则该复合物降解靶mRNA。若miRNA与靶mRNA不完全互补，则起到封闭mRNA的作用，抑制其翻译过程。
1.2 microRNA作用机制 研究表明人类基因组中约有30%基因受miRNA调控，miRNA具有广泛的基因调节功能。每个miRNA可以有多个靶基因 ,而几个 miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达，提示miRNA可能通过多元化途径调控靶基因表达。microRNA之间还可能存在协同、拮抗等相互作用，从而表现出microRNA功能作用多样性。但是在不同的组织中，都有特异的miRNA占主导地位。
2 microRNA检测方法
目前miRNA常用检测方法有：（1）Northern blotting 法：是经典的探针杂交检测法，但特异性和灵敏度不高，只能检测表达量非常大的microRNAs而且不能定量检测，为此发展了用锁核酸(LNA)修饰的杂交探针来取代传统DNA探针技术,使Northern blotting法的检测灵敏度和特异性得到显著改善；（2）实时荧光定量 PCR法(Real-time PCR)：用于基因表达的定量和用 DNA阵列技术检测证实基因的差异表达。具有敏感性高、可定量检测样本，需要量少等优点；（3）微阵列芯片技术(Microarray)：能够同时测定多个样本, 可以实现 miRNA 的高通量分析, 即在一块芯片上同时固定多个与miRNA序列互补的探针, 然后加入经过标记的样本RNA, 杂交后进行信号检测，但需要用其它方法对其结果进行检验。
3 microRNA與心血管疾病
越来越多研究发现 miRNA在生物发育过程中存在组织特异性表达, 参与形成并维持组织特异性。先后有数十种miRNA在心肌细胞中被鉴定，例如miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-133b、miRNA-195等，它们在心血管系统疾病发生发展过程中起着非常重要的作用。
3.1 microRNA与心肌肥厚及心力衰竭 miRNA是心肌细胞异常增殖生的潜在抑制物或加速剂。特定miRNA表达上调, 抑制心肌细胞异常增殖从而阻止或延缓心脏重构的进程；表达下调, 促进心肌细胞异常增殖, 加速心脏重构。目前已经明确心肌细胞肥大中发挥作用的miRNA主要有miRNA-1、miRNA-133、 miRNA-208、miRNA-195、miRNA-21。
miRNA-208是一种心脏组织特异性表达的miRNA，主要在心脏表达，但在肺脏也有微量表达，在心肌细胞增殖、 纤维化及调节β-心肌肌球蛋白链 (β-myosin heavy chain , β- MHC)表达中发挥作用。miRNA-208由α-心肌肌球蛋白链 (α-myosin heavy chain , α- MHC)基因的27位内含子编码, 后者可以促进心脏收缩蛋白的生成, 调节心肌增生。Thomas E. Callis等人在体内通过调控α- MHC的启动子使 miRNA-208a 过度表达时，心脏出现肥大。在体外使分离的心肌细胞中α- MHC过度表达后，心肌细胞变大。Van Rooij等[1]研究发现miRNA-208可能通过抑制靶基因甲状腺素受体相关蛋白1( THRAP1)而调控β- MHC的表达,发挥抗心肌肥厚、 纤维化和心力衰竭的作用。
3.2 microRNA与心肌损伤、心肌凋亡 Yin[2]等研究发现缺血预适应（IPC）处理后miRNA-1、miRNA-21和miRNA-24明显增加，机制类似于延迟缺血预适应，可能是通过上调内皮一氧化氮合酶、热休克蛋白（HSP70）以及热休克基因转录因子1发挥作用。进一步的研究发现小鼠经热休克处理后miRNA-1、miRNA-21和miRNA-24在心脏中显著增高，将分离出的miRNA给非热休克（HS）处理的小鼠注射，促凋亡基因被抑制而抗凋亡基因表达增加，缺血-再灌注损伤后的梗死面积显著减少，说明miRNA在缺血-再灌注损伤中发挥保护作用。
3.3 microRNA与心律失常 心肌细胞内离子通道功能异常可导致心脏冲动的形成或传导异常，从而诱发心律失常。新近研究表明有些心律失常可能与miRNA-1和miRNA133的表达异常有关。MiRNA-1和miRNA-133通过抑制靶基因HCN2/HCN4（超极化激活环化核苷酸调控阳离子通道基因）的表达和功能进而抑制了传导，引起心律失常；并且miRNA-1还可能通过下调KCNJ2和GJA1的表达，KCNJ2编码Kir2.1是负责调节心肌静息膜电位的主要钾离子通道亚单位，GJA1负责心室肌细胞之间的电耦联，故减慢心肌细胞传导和复极化，从而引起QRS波时程延长，Q-T间期延长；或抑制PP2A调节亚基B56α，导致依赖CaMKⅡ的RyR2过度磷酸化，进而促进肌浆网Ca2+释放，导致心律失常。Yang等[3]研究发现miRNA-1在冠状动脉性心脏病患者以及大鼠心梗模型的心脏中表达均明显上调。通过在梗死区域心肌内特异上调或下调miRNA-1的表达发现，miRNA-1的过表达可加重心律失常的发生而人为下调miRNA-1的表达则减轻心梗后心律失常的发生。进一步研究表明，心肌梗死后miRNA-1的过度表达抑制了靶基因KCNJ2（编码钾离子通道主要亚基Kir2.1）和GJA1（编码缝隙连接蛋白Cx43）的表达而引发心律失常。
快速激活延迟整流钾电流（Ikr）是人类心肌细胞动作电位3期快速复极的主要电流，它由延迟整流钾通道蛋白介导。研究表明，在兔糖尿病性心脏病时，miRNA-133在心肌表达上调，在转录后水平抑制ERG（Ether-a-Go-Go-相关基因）表达，使3相复极延长，从而导致QT间期延长。miRNA-133有望成为治疗LQTS的新靶点。
3.4 microRNA与血管内膜病变 血管内膜新生是动脉粥样硬化、再狭窄病变和高血压的共同病理基础。有人采用大鼠颈动脉球囊损伤模型观察了血管损伤后miRNA的变化规律，发现球囊损伤后血管组织中miRNA-21表达显著上调。继而采用反义寡核苷酸敲除miRNA-21可抑制颈动脉内膜球囊损伤后的血管内膜增生。进一步研究发现miRNA-21通过作用于PTEN、Bcl-2基因而抑制血管平滑肌细胞的增殖效應。这些发现有望解决支架术后、冠状动脉搭桥后、心脏移植后等血管再狭窄问题。
4 microRNA在相关治疗中的应用
运用RNA干扰治疗疾病的研究正在全世界开展。早在2004年，Soutsche就成功运用siRNA（小干扰RNA）沉默了小鼠内源性载脂蛋白B（apoB）的表达使总胆固醇的水平明显下降。Yang等[3]通过向小鼠梗死心肌注射经过脂质体预处理miRNA-1的2-氧-甲基修饰反义寡核苷酸特异下调了梗死心肌miRNA-1的表达，从而降低了心梗后心律失常的发生。Bonauer等研究发现,在肢体缺血及心肌梗死的小鼠模型中, 抑制miRNA- 92a的表达能增加血管形成,促进缺血受损组织的功能恢复。由此可见,如果这些方法安全有效的应用于人体，将大大促进疾病治疗技术的发展。
5 展望
miRNAs研究开辟了一个新的领域，即在基因水平诊断和治疗心血管疾病。当然，目前还存在诸多要解决的问题，如miRNA-1在哪种心血管疾病中表达增高？哪种应激信号增加miRNA-1表达，哪种应激信号减少miRNA-1表达？梗死或肥大后残存心肌组织的差别是什么？在心肌梗死或其他形式器质性心脏病发生后，降低miRNA-1活性能否减少心肌肥厚、改善机械功能并延长生命？总之，未来世界是RNA的世界，它将是生命科学领域里新的研究热点。
参考文献
[1] Van Rooij E , Sutherland LB, Q i X, et al.Control of stress-dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA [J]. Science , 2007 , 316( 5824): 575 -579 .
[2] Yin C, Salloum FN, Kukreja RC.A novel role of endothelial nitric oxide synthase an heat shock protein 70[J].Circ Res,2009,104(5):572-575.
[3] Yang B,Lin H ,Xiao J,et al.The muscle-specific microRNA miRNA-1 regulates cardiac arrhyhmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2[J]. Nat Med , 2007,13(4):486-491.