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【摘 要】目的：研究细胞凋亡增加是否为胎膜早破的一个发病机理和危险因素。方法：随机选择经阴道分娩的足月初产妇60例的胎膜，其中胎膜早破30例作为研究组，余30例 为对照组。结果：采用免疫组化法检测两组胎膜组织中细胞凋亡调控因子（Bax、Bcl-2）及细胞色素C（Cyt-C）的表达情况的阳性表达率高于对照组（p<0.005），但抑凋亡蛋白的Bcl-2阳性表达率两组间无统计学差异（p>0.005）。结论：胎膜早破的发生与促凋亡蛋白Bax、Cyt-c表达的增强相关，基因调控下胎膜细胞凋亡增加可能是胎膜早破的一个重要发病机制。
【关键词】胎膜早破；细胞凋亡；Bcl-2；Bax；细胞色素C
【中图分类号】R714 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）05-2742-01
胎膜早破（Premature rupture of membranes，PROM）是指临产前的胎膜破裂，是严重威胁母儿健康的产科常见并发症。近年来有关胎膜早破的病因学方面的研究日趋增多。目前主要是从分子和基因水平上探讨胎膜本身结构的变化，研究表明胎膜中存在凋亡并受一些凋亡调节基因的调控[1]，但胎盘上的凋亡调控机理尚无定论。本研究皆在通过免疫组化技术了解细胞凋亡调控基因Bcl-2、Bax、细胞色素-C（Cytochrome-c，Cyt-c），在胎膜中的表达及相互关系，探讨其在PROM中的作用，明确其是否为PROM的一个发病机制或危险因素，为胎膜早破的预防和治疗提供科学的依据和新思路。
1 资料与方法
1.1研究对象
随机选择2009年12月至2011年1月在我院妇科科住院的经阴道分娩的足月初产妇60例，其中30例PBOM孕妇作为研究对象（PROM组），排除机械性损伤和多胎、胎位异常、头盆不称等原因所至的PROM，临床无感染征象，无其他产科合并症和并发症，近期无外伤和性交等明显诱因，且PROM组均在破膜12h以内分娩；未发生PROM的孕妇作为正常妊娠组（对照组），符合上述条件，并与研究组年龄、孕周相对应。
两组孕妇年龄、孕周、孕次及新生儿体重的差异均无统计学意义，资料具有可比性。PROM诊断标准按乐杰主编的第6版《妇产科学》[2]中的相关标准。
1.2方法
1.2.1标本采集：两组孕妇均在胎盘娩出后10min内于胎膜破裂口处3cm内采取2cmX2cm的新鲜羊膜组织。标本采取后立即用生理盐水洗净血迹，无菌棉签试蜕膜组织后，置入4%甲醛溶液中固定，常规石蜡包理标本，连续4μm厚切片4张，其中3张备免疫组化染色用，另1张备随机抽取予PBS染色行阴性对照。
1.2.2实验方法：用免疫组化SP法分别检测标本中的Bas、Bcl-2、Cyt-c的性表达。北京中杉金桥生物技术有限公司提供鼠抗人Bax单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体及鼠抗人Cyt-c单克隆抗体，SP系列工作盒和显色剂试剂盒。染色按试剂盒说明操作、抗稀释度1：50，磷酸盐缓冲液代替-抗作阴性对照，分别用已知Bax、Bcl-2、Cyt-c阳性组织切片作阳性对照。
1.2.3结果判定[3] ：光学显微镜下观察，以细胞浆内出现浅黄色、黄色或棕黄色沉着，染色明显高于背景为阳性细胞。每例标本随机选取5个高倍视野（X400），计算每个视野阳性细胞比例得分和染色强度得分，以5个视野的平均值确定阳性细胞比例得分和染色强度得分，以5个视野的平均值确定阳性表达度。阳性表达度=阳性细胞得分+染色强度得分：①阳性细胞评定标准：无阳性细胞=0分；阳性细胞<25%=1分，25%～50%=2分，>50%=3分；②染色强度评定标准：不着色=0分，浅黄色=1分，黄色=2分，棕黄色=3分，均值0分为阴性（一），1～2分为弱阳性=（+），3～4分为中度阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。
1.3统计学方法
应用SPSS11.5软件进行统计学处理，各数据用x±s表示。采用t检验，x2检验，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
Bcl-2、Bax、Cyt-c阳性反应物：Cyt-c和促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2在绒毛膜滋养细胞和羊膜上皮细胞、成纤维细胞及间质胞浆内均有表达。两组中Bcl-2阳性表达率无统计学差异；PROM组Bax和Cyt-c的阳性表达率均高于对照组，差异有显著性意义，见表1-3。
3 讨论
3.1胎膜早破与细胞凋亡
胎膜由胎膜細胞及其所产生的细胞外基质组成，在整个妊娠过程中胎膜的组织结构对维护胎膜的完整性，保证妊娠的顺利发展，防止胎膜早期破裂的发生起着重要的作用。从整个妊娠过程观察，覆盖于子宫颈内口的胎膜组织及其变化是趋向于变薄和弱化，其目的是利于产程的开始[4]。若这个过程加速或程度加重，势必导致胎膜组织结构的改变，当胎膜组织的结构发生异常，以至少胎膜组织不能随妊娠以后逐渐增加的宫腔内的压力即可发生胎膜破裂。因此，胎膜细胞功能及形态、结构发生改变将直接导致胎膜性状的改变，乃至造成胎膜的破裂。
细胞凋亡（apoptosis，APO）即细胞的程序化死亡，是因为细胞内外环境变化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起细胞的主动死亡过程，是机体组织清除受损、衰老或多余细胞的一种自杀方式，它对于胚胎的发生，机体正常的生长发育以及免疫监督，免疫防御系统功能和维持等方面都具有重要意义[5]。多项研究资料表明[6-8]，PROM者的胎膜组织明显变薄，而绒毛膜的胶原纤维、基底膜、纤维母细胞和滋养叶细胞呈现发育不良和老化现象，而羊膜结缔组织中的肌成纤维细胞的数密度和体密度明显变低；在胎盘及胎膜组织中可以可见凋亡细胞的存在；在正常足月分娩和PROM产程发动中，包括胶原、氨基葡聚糖和层粘连蛋白等在内的细胞外基质成分无明显改变。 因此，细胞凋亡可能在胎膜细胞生长、发育、分化和再生过程乃至胎膜结构重建中起着重要的调节作用，这可能与胎膜细胞发生凋亡后产生细胞外基质减少有关，这些基质对胎膜起着骨架支撑作用，是维持胎膜结构的重要部分，其产生减少后，胎膜强度和韧度减弱，最终导致PROM的发生。
3.2 Bcl-2、Bax与胎膜早破的关系
凋亡作为一种生理或病理性的细胞消亡，普遍存在于生物界，机体通过凋亡消除衰老的细胞并代这以新的细胞，从而维持组织器官中细胞数量的稳定。细胞凋亡的发生受相关基因蛋白的调控，其中抑制细胞凋亡的基因蛋白Bcl-2在细胞凋亡的分子调节中起着重要的作用，它抑制细胞凋亡，阻止程序细胞死亡，延长细胞生存期。促进细胞凋亡的基因蛋白Bax起着加速细胞凋亡的作用。一般认为，这两类蛋白质的比值决定细胞在受到凋亡信号刺激时否发生凋亡。Bcl-2/Bax异二聚体的比值在凋亡中起到重要作用，其比值越低，凋亡越明显[9]。
本研究结果显示，Bcl-2与Bax在胎膜上所有细胞都有表达，说明二者的确参与了胎膜上细胞凋亡的调控。在发生RPOM胎膜组织中Bcl-2的阳性表达率为90%，对照组为93.3%，经统计学检验两组结果无明显差异（p>0.05），PROM组中Bax的阳性率表达为90%，对照组为63.3%，经统计学检验两组结果显著差异（P<0.005）。这种Bax与Bcl-2的不平衡的表达结果，证实了PROM组的胎膜细胞凋亡的同时，也证实了细胞内Bcl-2与Bax的比例调节了凋亡的同时，也证实了细胞内Bcl-2与Bax的比较调节了凋亡的发生，当Bax过多不能被结合时则会加速细胞凋亡。过度细胞凋亡可刺激基质金属蛋白酶（MMPS）的表达、活化，而MMPS是降解胎膜细胞外基质和胶原纤维的主要蛋白水解酶[10]。在未受产程影响的宫颈口处胎膜明显弱化，张力度下降，细胞凋亡和MMPS水平均升高，说明细胞凋亡与MMPS具有协同作用，促使胎膜组织结构发生病理改变，最终导致PROM[11]。
本研究中，PROM组Cyt-c的阳性表达率为73.3%，对照组为43.3%，经统计学检验两组结果有显著性差异，从而也证实了早破胎膜中的细胞凋亡的增加。由于促凋亡蛋白Bax、Cyt-c阳性表达率均为PROM组高于对照组，可以推断在PROM的胎膜中Bax与Cyt-c间存在正相关关系，与Korsmeyer等[13]的报道相一致。
综上所述，PROM的发生是多个相关因素经多种途径触发的多个基因调控的胎膜的细胞外基质降解和细胞凋亡的结果，进一步阐明胎膜早破确切的发病机制仍是我們指导防治本病的关键。我们认为，PROM中细胞凋亡的增加导致了胎膜降解的增加，最终导致了胎膜的破裂。本研究证实，胎膜早破的发生与Bax、Cyt-c表达的增强相关，基因调控下的胎膜细胞凋亡增加可能是PROM的一个重要的发病机制，故通过对凋亡调控基因Bax、Cyt-c与RPOM相关性的研究有助于我们增加对其发病机理的认识，其研究可能对胎膜早破的预防和治疗提供重要的依据。
参考文献
[1] 冯妍，其木格.胎膜早破与细胞凋亡的相关性研究[J].中外医学研究，2009，7（6）：17-19.
[2] 乐杰，主编.妇产科学[M]第6版.北京：人民卫生出版社，2004，145-146.
[3] 许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].中国癌症杂志，1996，6（4）：229-231.
[4] RUNIC R，et al.Apoptosis and Fas expression in human fetal menbrance[J]. Clin Endocrinol Metab，1998，83（3）：660.
[5] 樊廷俊，夏兰，韩贻仁，等.线粒体与细胞凋亡[J].生物化学与生物物理学报，2001，33（1）：7-12.
[6] 赖仁胜，周溶，李祥周，等.胎膜早破的生物生理学机制探讨[J].中华妇产科杂志，1990，28（9）：521-522.
[7] 肖小敏，王自能.肌成纤维细胞与胎膜早破[J].中华妇产科杂志，1992，27（2）：108.
[8] 李小毛，沈慧敏，侯红瑛，等.关于临产前后胎盘与胎膜中细胞凋亡的研究[J].中华围产医学杂志，2003，3（2）：71-72.
[9] 任云青.子宫内膜异位症与细胞凋亡[J].医学综述，2005，11（8）：689-694.
[10] 邱晓红，李荷莲.基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9及抑制因子TIMP-1、TIMP-2在子宫内膜异位症中的表达及意义[J].中国实用妇科与产科杂志，2004，20（3）：158-160.
[11] 卢宗杰，简丽.胎膜早破绒毛膜羊膜bFGG与Bax、Bcl-2的表达[J].中华围产医学杂志，2006，9（4）：240-242.
【关键词】胎膜早破；细胞凋亡；Bcl-2；Bax；细胞色素C
【中图分类号】R714 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）05-2742-01
胎膜早破（Premature rupture of membranes，PROM）是指临产前的胎膜破裂，是严重威胁母儿健康的产科常见并发症。近年来有关胎膜早破的病因学方面的研究日趋增多。目前主要是从分子和基因水平上探讨胎膜本身结构的变化，研究表明胎膜中存在凋亡并受一些凋亡调节基因的调控[1]，但胎盘上的凋亡调控机理尚无定论。本研究皆在通过免疫组化技术了解细胞凋亡调控基因Bcl-2、Bax、细胞色素-C（Cytochrome-c，Cyt-c），在胎膜中的表达及相互关系，探讨其在PROM中的作用，明确其是否为PROM的一个发病机制或危险因素，为胎膜早破的预防和治疗提供科学的依据和新思路。
1 资料与方法
1.1研究对象
随机选择2009年12月至2011年1月在我院妇科科住院的经阴道分娩的足月初产妇60例，其中30例PBOM孕妇作为研究对象（PROM组），排除机械性损伤和多胎、胎位异常、头盆不称等原因所至的PROM，临床无感染征象，无其他产科合并症和并发症，近期无外伤和性交等明显诱因，且PROM组均在破膜12h以内分娩；未发生PROM的孕妇作为正常妊娠组（对照组），符合上述条件，并与研究组年龄、孕周相对应。
两组孕妇年龄、孕周、孕次及新生儿体重的差异均无统计学意义，资料具有可比性。PROM诊断标准按乐杰主编的第6版《妇产科学》[2]中的相关标准。
1.2方法
1.2.1标本采集：两组孕妇均在胎盘娩出后10min内于胎膜破裂口处3cm内采取2cmX2cm的新鲜羊膜组织。标本采取后立即用生理盐水洗净血迹，无菌棉签试蜕膜组织后，置入4%甲醛溶液中固定，常规石蜡包理标本，连续4μm厚切片4张，其中3张备免疫组化染色用，另1张备随机抽取予PBS染色行阴性对照。
1.2.2实验方法：用免疫组化SP法分别检测标本中的Bas、Bcl-2、Cyt-c的性表达。北京中杉金桥生物技术有限公司提供鼠抗人Bax单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体及鼠抗人Cyt-c单克隆抗体，SP系列工作盒和显色剂试剂盒。染色按试剂盒说明操作、抗稀释度1：50，磷酸盐缓冲液代替-抗作阴性对照，分别用已知Bax、Bcl-2、Cyt-c阳性组织切片作阳性对照。
1.2.3结果判定[3] ：光学显微镜下观察，以细胞浆内出现浅黄色、黄色或棕黄色沉着，染色明显高于背景为阳性细胞。每例标本随机选取5个高倍视野（X400），计算每个视野阳性细胞比例得分和染色强度得分，以5个视野的平均值确定阳性细胞比例得分和染色强度得分，以5个视野的平均值确定阳性表达度。阳性表达度=阳性细胞得分+染色强度得分：①阳性细胞评定标准：无阳性细胞=0分；阳性细胞<25%=1分，25%～50%=2分，>50%=3分；②染色强度评定标准：不着色=0分，浅黄色=1分，黄色=2分，棕黄色=3分，均值0分为阴性（一），1～2分为弱阳性=（+），3～4分为中度阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。
1.3统计学方法
应用SPSS11.5软件进行统计学处理，各数据用x±s表示。采用t检验，x2检验，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
Bcl-2、Bax、Cyt-c阳性反应物：Cyt-c和促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2在绒毛膜滋养细胞和羊膜上皮细胞、成纤维细胞及间质胞浆内均有表达。两组中Bcl-2阳性表达率无统计学差异；PROM组Bax和Cyt-c的阳性表达率均高于对照组，差异有显著性意义，见表1-3。
3 讨论
3.1胎膜早破与细胞凋亡
胎膜由胎膜細胞及其所产生的细胞外基质组成，在整个妊娠过程中胎膜的组织结构对维护胎膜的完整性，保证妊娠的顺利发展，防止胎膜早期破裂的发生起着重要的作用。从整个妊娠过程观察，覆盖于子宫颈内口的胎膜组织及其变化是趋向于变薄和弱化，其目的是利于产程的开始[4]。若这个过程加速或程度加重，势必导致胎膜组织结构的改变，当胎膜组织的结构发生异常，以至少胎膜组织不能随妊娠以后逐渐增加的宫腔内的压力即可发生胎膜破裂。因此，胎膜细胞功能及形态、结构发生改变将直接导致胎膜性状的改变，乃至造成胎膜的破裂。
细胞凋亡（apoptosis，APO）即细胞的程序化死亡，是因为细胞内外环境变化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起细胞的主动死亡过程，是机体组织清除受损、衰老或多余细胞的一种自杀方式，它对于胚胎的发生，机体正常的生长发育以及免疫监督，免疫防御系统功能和维持等方面都具有重要意义[5]。多项研究资料表明[6-8]，PROM者的胎膜组织明显变薄，而绒毛膜的胶原纤维、基底膜、纤维母细胞和滋养叶细胞呈现发育不良和老化现象，而羊膜结缔组织中的肌成纤维细胞的数密度和体密度明显变低；在胎盘及胎膜组织中可以可见凋亡细胞的存在；在正常足月分娩和PROM产程发动中，包括胶原、氨基葡聚糖和层粘连蛋白等在内的细胞外基质成分无明显改变。 因此，细胞凋亡可能在胎膜细胞生长、发育、分化和再生过程乃至胎膜结构重建中起着重要的调节作用，这可能与胎膜细胞发生凋亡后产生细胞外基质减少有关，这些基质对胎膜起着骨架支撑作用，是维持胎膜结构的重要部分，其产生减少后，胎膜强度和韧度减弱，最终导致PROM的发生。
3.2 Bcl-2、Bax与胎膜早破的关系
凋亡作为一种生理或病理性的细胞消亡，普遍存在于生物界，机体通过凋亡消除衰老的细胞并代这以新的细胞，从而维持组织器官中细胞数量的稳定。细胞凋亡的发生受相关基因蛋白的调控，其中抑制细胞凋亡的基因蛋白Bcl-2在细胞凋亡的分子调节中起着重要的作用，它抑制细胞凋亡，阻止程序细胞死亡，延长细胞生存期。促进细胞凋亡的基因蛋白Bax起着加速细胞凋亡的作用。一般认为，这两类蛋白质的比值决定细胞在受到凋亡信号刺激时否发生凋亡。Bcl-2/Bax异二聚体的比值在凋亡中起到重要作用，其比值越低，凋亡越明显[9]。
本研究结果显示，Bcl-2与Bax在胎膜上所有细胞都有表达，说明二者的确参与了胎膜上细胞凋亡的调控。在发生RPOM胎膜组织中Bcl-2的阳性表达率为90%，对照组为93.3%，经统计学检验两组结果无明显差异（p>0.05），PROM组中Bax的阳性率表达为90%，对照组为63.3%，经统计学检验两组结果显著差异（P<0.005）。这种Bax与Bcl-2的不平衡的表达结果，证实了PROM组的胎膜细胞凋亡的同时，也证实了细胞内Bcl-2与Bax的比例调节了凋亡的同时，也证实了细胞内Bcl-2与Bax的比较调节了凋亡的发生，当Bax过多不能被结合时则会加速细胞凋亡。过度细胞凋亡可刺激基质金属蛋白酶（MMPS）的表达、活化，而MMPS是降解胎膜细胞外基质和胶原纤维的主要蛋白水解酶[10]。在未受产程影响的宫颈口处胎膜明显弱化，张力度下降，细胞凋亡和MMPS水平均升高，说明细胞凋亡与MMPS具有协同作用，促使胎膜组织结构发生病理改变，最终导致PROM[11]。
本研究中，PROM组Cyt-c的阳性表达率为73.3%，对照组为43.3%，经统计学检验两组结果有显著性差异，从而也证实了早破胎膜中的细胞凋亡的增加。由于促凋亡蛋白Bax、Cyt-c阳性表达率均为PROM组高于对照组，可以推断在PROM的胎膜中Bax与Cyt-c间存在正相关关系，与Korsmeyer等[13]的报道相一致。
综上所述，PROM的发生是多个相关因素经多种途径触发的多个基因调控的胎膜的细胞外基质降解和细胞凋亡的结果，进一步阐明胎膜早破确切的发病机制仍是我們指导防治本病的关键。我们认为，PROM中细胞凋亡的增加导致了胎膜降解的增加，最终导致了胎膜的破裂。本研究证实，胎膜早破的发生与Bax、Cyt-c表达的增强相关，基因调控下的胎膜细胞凋亡增加可能是PROM的一个重要的发病机制，故通过对凋亡调控基因Bax、Cyt-c与RPOM相关性的研究有助于我们增加对其发病机理的认识，其研究可能对胎膜早破的预防和治疗提供重要的依据。
参考文献
[1] 冯妍，其木格.胎膜早破与细胞凋亡的相关性研究[J].中外医学研究，2009，7（6）：17-19.
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[7] 肖小敏，王自能.肌成纤维细胞与胎膜早破[J].中华妇产科杂志，1992，27（2）：108.
[8] 李小毛，沈慧敏，侯红瑛，等.关于临产前后胎盘与胎膜中细胞凋亡的研究[J].中华围产医学杂志，2003，3（2）：71-72.
[9] 任云青.子宫内膜异位症与细胞凋亡[J].医学综述，2005，11（8）：689-694.
[10] 邱晓红，李荷莲.基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9及抑制因子TIMP-1、TIMP-2在子宫内膜异位症中的表达及意义[J].中国实用妇科与产科杂志，2004，20（3）：158-160.
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