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本发明提供使用酶不经分离操作而特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的方法和用于此的测定试剂盒。筛选从糖化血红蛋白或其片段的糖化β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不实质性地从糖化血红蛋白或其片段的糖化α链N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。通过使用通过该筛选方法获得的蛋白酶,提供了特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的方法和测定试剂盒。根据本发明,可以不经分离操作而特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端。