【摘 要】
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本文报道用一对与大肠杆菌编码Ｌ－天门冬酰胺酶Ⅱ（Ｌ－ＡｓＰｓⅡ）的基因ａｎｓＢ两侧序列互补的寡核苷酸Ｌ１、Ｌ２作引物，以Ｌ－ＡＳＰｓⅡ的野生型生产菌ｃＰＵ２１０００９染色体为模板，经ＰＣＲ扩增得到长约１．６Ｋｂ的ＤＮＡ片段。该片段通过以ＬＰ１、ＬＰ２为内引物的ＰＣＫ反应
【机 构】
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中国药科大学生化教研室，南京铁道医学院生化教研室
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本文报道用一对与大肠杆菌编码Ｌ－天门冬酰胺酶Ⅱ（Ｌ－ＡｓＰｓⅡ）的基因ａｎｓＢ两侧序列互补的寡核苷酸Ｌ１、Ｌ２作引物，以Ｌ－ＡＳＰｓⅡ的野生型生产菌ｃＰＵ２１０００９染色体为模板，经ＰＣＲ扩增得到长约１．６Ｋｂ的ＤＮＡ片段。该片段通过以ＬＰ１、ＬＰ２为内引物的ＰＣＫ反应，证明包含了ａｎｓＢ基因的编码序列。将此片段经ｘｂａ１、ＨｉｎｄⅡ消化，插入质粒ＰＵＣ１８、ＰＵＣ１９上构建重组质粒ＰＵＡ１８、ＰＵＡ１９，分别转化Ａｓ１．１１８７，Ａｓ１．１１９３，ＨＢ１０１，９６３７，ＪＭ１０７，７１／１８，ＣＰＵ２１０００９等宿主菌，筛选得到Ｌ－ＡＳＰｓⅡ酶活力明显提高的８株阳性转化子。在１Ｌ生物反应器中，ＬＢ培养基３７℃下培养２４ｈ，其酶活在６．２～３１．８１Ｕ。ｍｌ之间。其中ＣＴＡ８表达Ｌ－ＡＳＰｓⅡ水平最高，达到３１．８１Ｕ／ｍｌ．各基因工程菌株较之野生型生产菌体ＣＰＵ２１０００９，其生产Ｌ－ＡＳＰｓⅡ水平提高了５～２６倍。而且ＩＰＴＧ诱导对工程菌表达Ｌ－ＡＳＰｓⅡ的水平几无影响。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得工程菌表达的Ｌ－ＡＳＰｓⅡ分子量约为１４０Ｋｄ．薄层扫描结果显示：ＣＴＡ７、ＣＴＢ８、ＣＴＡ９所产生的Ｌ－ＡＳＰｓ?
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