【摘 要】
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本文报道用一对与大肠杆菌编码L-天门冬酰胺酶Ⅱ(L-AsPsⅡ)的基因ansB两侧序列互补的寡核苷酸L1、L2作引物,以L-ASPsⅡ的野生型生产菌cPU210009染色体为模板,经PCR扩增得到长约1.6Kb的DNA片段。该片段通过以LP1、LP2为内引物的PCK反应
【机 构】
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中国药科大学生化教研室,南京铁道医学院生化教研室
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本文报道用一对与大肠杆菌编码L-天门冬酰胺酶Ⅱ(L-AsPsⅡ)的基因ansB两侧序列互补的寡核苷酸L1、L2作引物,以L-ASPsⅡ的野生型生产菌cPU210009染色体为模板,经PCR扩增得到长约1.6Kb的DNA片段。该片段通过以LP1、LP2为内引物的PCK反应,证明包含了ansB基因的编码序列。将此片段经xba1、HindⅡ消化,插入质粒PUC18、PUC19上构建重组质粒PUA18、PUA19,分别转化As1.1187,As1.1193,HB101,9637,JM107,71/18,CPU210009等宿主菌,筛选得到L-ASPsⅡ酶活力明显提高的8株阳性转化子。在1L生物反应器中,LB培养基37℃下培养24h,其酶活在6.2~31.81U。ml之间。其中CTA8表达L-ASPsⅡ水平最高,达到31.81U/ml.各基因工程菌株较之野生型生产菌体CPU210009,其生产L-ASPsⅡ水平提高了5~26倍。而且IPTG诱导对工程菌表达L-ASPsⅡ的水平几无影响。SDS-PAGE测得工程菌表达的L-ASPsⅡ分子量约为140Kd.薄层扫描结果显示:CTA7、CTB8、CTA9所产生的L-ASPs?
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