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[摘要]目的探讨多聚酶链反应（PCR）检测免疫球蛋白重链基因重排在原发性胃肠道淋巴组织增生性疾病中的良恶性鉴别中的应用价值。方法选取存档蜡块45例，采用HE常规染色及SP免疫组化方法进行组织学分类，运用PCR半巢式扩增免疫球蛋白重链基因重排，2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果IgH FR3A和IgH FR3A+FR2A在MALT淋巴瘤的阳性检测率分别为60.7%（17/28）和75.0%（21/28），在DLBCL中的阳性检测率分别为60.0%（9/15）和73.3%（11/15），在MCL中的阳性检测率分别为100.0%（1/1）和100.0%（1/1）。IgH FR3A在胃肠道淋巴瘤中的阳性检测率为60.0%。IgH FR3A联合IgH FR2Ad在胃肠道淋巴瘤中的阳性检出率为73.3%（33/45）。结论采用PCR方法检测免疫球蛋白重链基因重排能够作为淋巴瘤诊断的有效辅助手段，有助于对原发性胃肠道淋巴组织增生性疾病的良恶性做出正确的诊断。
[关键词]胃肠道淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；基因重排；多聚酶链反应；免疫球蛋白重链基因
[中图分类号]R733
[文献标识码]A
[文章编号]2095-0616（2016）03-29-04
淋巴瘤是起源于淋巴组织及淋巴结的恶性肿瘤，原发性胃肠道淋巴瘤是结外淋巴瘤的最好发部分。原发性胃肠道淋巴瘤占结外淋巴瘤的30%～45%。原发性淋巴瘤由于其临床表现无特殊性，尤其在早期的恶性淋巴瘤由于其更缺乏特异性，因此临床较难做出正确诊断，易造成误诊。病理诊断淋巴瘤较为可靠，借助形态学和免疫组织化学能对大部分淋巴瘤做出明确的诊断，但对一些疑难病例仍然不能做出正确诊断，未能得到及时的正确诊断不利于临床医生做出最佳的治疗方案和进行必要的预后评估。近年来，针对淋巴瘤免疫球蛋白重链（immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排检测已经成为临床上诊断淋巴瘤的一项必要手段，成为鉴别诊断淋巴瘤的一种新的有力工具，
本研究对此进行初步研究。
1.资料与方法
1.1一般资料
收集2008年10月～2014年10月郑州人民医院收治胃肠道B细胞非霍奇金淋巴瘤（Bcell non-Hodgkin lymphoma，B-NHL）45例，来自内镜活检和手术标本均经病理证实。男27例，女18例，年龄21-77岁（中位年龄52岁）。阳性对照为Raii细胞株，阴性对照为1例淋巴组织反应性增生。
1.2临床表现
45例胃肠道B-NHL患者中出现腹痛37例（82.2%），腹胀10例（22.2），血便10例（22.2%），发热8例（17.8%），腹部包块7例（15.6%），黑便6例（13.3%），消瘦5例（11.1%），黏液便5例（11.1%），腹泻2例（4.4%）。45例病变累及胃21例（46.7%），小肠2例（4.4%），回盲部3例（6.7%），结肠10例（22.2%），直肠3例（6.37%），小肠合并结肠1例（2.7%）。其中表现为淋巴结转移26例（57.8%），未查见淋巴结转移19例（42.3%）。
1.3方法
1.3.1免疫组化所有标本经中性福尔马林固定、常规石蜡包埋、4-5um连续组织切片，除进行常规HE染色以外，采用免疫组化S-P法进行免疫表型标记：LCA（2B11，DAKO）、CD3（F7.2.38，DAKO），CD45RO（OPD4，DAKO）、CD20（L26，DAKO）、CDIO（MX002，DAKO）、CDl5（Carb-3，DAKO）、CD30（Ber-2、DAKO）、Bcl-2（SP66，DAKO）、Bcl-6（LN22，DAKO）、CyclinD-1（DCS-6，DAKO）、PAX-5（SP34，DAKO）、kappalight chain（L1C1，DAKO）
和lambda light chain（LAM03+HP6054，DAKO）标记轻链。依据不同免疫表型表达情况并根据2008年WHO淋巴及造血系统肿瘤分类标准对所有病例进行分类。
1.3.2组织分型常规HE制片，结合免疫组化结果，所有病例经由2位以上病理学专家共同阅片确诊为非霍奇金B细胞淋巴瘤，其中胃肠道黏膜相关淋巴瘤（mucosa associated lymphoid tissuelymphoma，MALT）28例，弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）15例，滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）1例，套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）1例。
1.3.3DNA提取及半巢式PCR反应石蜡组织10um连续切片5张，常规酚一氯仿法抽提DNA。采用半巢式PCR。一致性v区引物（FR2A）：5’TGGA/GTC CGC/A CAG G/CCT/C T/CCN GG 3’一致性V区引物（FR3A）：5’ACA CGG C（C/T）（G/C）TGT ATT ACT GT 3’，（J区引物）LJH：5’TGAGGA GAC GGT GAC C 3’，（J区引物）VLJH：5’GTG ACC AGG GT（A/G/C/T）CCT TGG CCCCAG 3’。进行半巢式反应，第一轮PCR用引物FR3A（FR2A）+LJH，其产物稀释100倍作为模板，FR3A（FR2A）+VLJH进行第二轮PCR反应。总体积25uL：10×buffer 2.5uL，MgCl，1.8uL（终浓度1.8mM），dNTP 1.5uL（终浓度10uM），引物各0.2uL终浓度200nM），TaqPlus酶0.2uL（1u），模板DNA 1UL，体积不足部分双蒸水补足。所有PCR反应均在94℃预变性6min，94℃变性lmin，55℃退火lmin，72℃延伸lmin，40个循环，反应结束后在72℃延伸10min，然后4～C放置。产物长度70-130bp。已知阳性病例做阳性对照，反应性淋巴组织增生做阴性对照，缓冲液做空白对照。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳。所需引物和试剂均购自上海生工公司。 1.3.4结果判定与标准DNA分子量对照，在期待目的条带范围内出现1～2条特异性清晰条带为阳性，IgH FR2A的片段长度为230～270bp；IgH FR3A为80～120bp；并参照McCarthy提出的IgH基因重排阳性结果的4条判断标准：（1）电泳条带宽度不超过lmm，边缘整齐；（2）电泳产物在期望的大小范围内；（3）如背景上无涂抹带，亦无引物二聚体则是PCR扩增失败，而非阴性如果出现；（4）期望大小之外的其他条带，均为人工假象。
2.结果
2.1大体形态
溃疡型26例（57.8%），其中多发溃疡8例，巨大溃疡17例，浅表溃疡1例；结节型12例（26.7%）；结节溃疡型2例（4.4%）；弥漫浸润型5例（11.1%）。
2.2免疫组化结果
45例LCA（+）、42例CD20（+）、1例CD45RO灶（+）、44例CD45R0（-）、23例K（+）、18例入（+）。
2.3 IgH基因重排检测结果
IgH FR3A和IgH FR3A+FR2A在MALT淋巴瘤的阳性检测率分别是60.7%（17/28）和75.0%（21/28），在DLBCL中的阳性检测率分别是60.0%（9/15）和73.3%（11/15），在MCL中的阳性检测率分别是100.0%（1/1）和100.0%（1/1），在FL中的阳性检测率是0。IgH FR3A在胃肠道淋巴瘤中的阳性检测率是60.0%。IgH FR3A联合IgH FR2A中胃肠道淋巴瘤中的阳性检出率是73.3%。
3.讨论
首先表现为胃肠道受累的淋巴瘤称为原发性胃肠道淋巴瘤，原发性胃肠道术前诊断存在一定难度，x线钡餐图像和钡灌肠征象分别与胃癌和结肠癌之间不易区别。胃镜多表现为黏膜皱装明显增厚，呈现不规则隆起，可见结节状或广泛糜烂以及不规则溃疡等表现，多具有多形性、多灶性、弥漫性和假性愈合等特点。胃肠道恶性淋巴瘤确诊的关键依然依赖于病理学诊断，传统上依据HE常规染色切片联合免疫组织化学虽然能确诊大部分病例，但仍然有一部分病例由于其形态学和免疫组织化学的非典型性而造成误诊。
B淋巴细胞在分化过程中，位于14号染色体上的免疫球蛋白重链基因的可变区（V）、多样区（D）和连接区（J）要发生随机基因重排。由于重排的随机性以及重排片段连结区核苷酸的随机删除或插入等多样性使得每一克隆B淋巴细胞均具有自身的重排方式，由此产生了上万种不同免疫球蛋白。作为机体应对外界不良刺激，正常淋巴组织反应性增生产生多样的免疫球蛋白。恶性淋巴瘤是单克隆性增生，理论上所有的克隆表现为一种IgH基因重排。对Ig HV区进行基因重排检测，通常可判定克隆来源性质，判定单克隆和多克隆可明确病变性质。因此检测IgH基因的重排方式可作为确定细胞克隆起源。
目前临床最常用的基因重排检测引物设计是检测FRⅡ引物FR2A及针对FRⅢ引物FR3A，利用FR3A（FR2A）及JH引物主要扩增IgH V区的CDRⅢ，CDRⅢ是IgH V区变异程度最高的区域，使用FR3A（FR2A）引物，采用FR3A引物检测淋巴瘤的检测率为60.0%，联合FR2A本组研究PCR（FR2A+FR3A）在胃肠道B-NHL中IgH基因克隆性重排检测率可达73.3%左右与文献报道近似。
本研究检测45例NHL，IgH基因单克隆重排33例，检测率为73.3%，与文献报道近似。VH区基因突变程度的不同会引起FR引物与靶序列特定结合有效性产生一定差异；IgH基因不正确或不完全重排；有些样本中多克隆B细胞数量优势存在，导致无法检测出单克隆细胞；这些因素的存在皆可造成IgH基因克隆性重排检测出现假阴性结果。本组假阴性结果为12例，本组出现的假阴性结果可能原因为：（1）与FR3A DNA互补的片段可能缺失；（2）B细胞在恶性转变过程中可能发生突变，不能与引物发生反应；（3）单对引物不能检测恶性淋巴瘤分化过程中发生的形式多样的基因重排；（4）在单克隆性的肿瘤B细胞中出现一定数量的多克隆B细胞。假阴性结果的存在提示我们在分析基因重排检测结果时，阴性结果不能完全排除淋巴瘤的可能。
本组45例B-NHL的IgH基因重排检测琼脂糖凝胶电泳大部分为单一条带，2例出现二条重排带，出现这种结果的原因可能在于肿瘤中的两个等位基因同时发生了重排，还可能存在少数B细胞性克隆增生，由于克隆间存在一定差异，出现了一个或二个基因重排带。
PCR检测IgH重排对淋巴瘤的精准诊断具有一定的辅助作用，对一些疑难病例采用IgH基因重排检测帮助明确淋巴瘤的诊断，为临床提供正确的诊断，制定科学规范的治疗方案具有一定的帮助，对有条件开展基因重排检测的医院可考虑推广开展。
[关键词]胃肠道淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；基因重排；多聚酶链反应；免疫球蛋白重链基因
[中图分类号]R733
[文献标识码]A
[文章编号]2095-0616（2016）03-29-04
淋巴瘤是起源于淋巴组织及淋巴结的恶性肿瘤，原发性胃肠道淋巴瘤是结外淋巴瘤的最好发部分。原发性胃肠道淋巴瘤占结外淋巴瘤的30%～45%。原发性淋巴瘤由于其临床表现无特殊性，尤其在早期的恶性淋巴瘤由于其更缺乏特异性，因此临床较难做出正确诊断，易造成误诊。病理诊断淋巴瘤较为可靠，借助形态学和免疫组织化学能对大部分淋巴瘤做出明确的诊断，但对一些疑难病例仍然不能做出正确诊断，未能得到及时的正确诊断不利于临床医生做出最佳的治疗方案和进行必要的预后评估。近年来，针对淋巴瘤免疫球蛋白重链（immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排检测已经成为临床上诊断淋巴瘤的一项必要手段，成为鉴别诊断淋巴瘤的一种新的有力工具，
本研究对此进行初步研究。
1.资料与方法
1.1一般资料
收集2008年10月～2014年10月郑州人民医院收治胃肠道B细胞非霍奇金淋巴瘤（Bcell non-Hodgkin lymphoma，B-NHL）45例，来自内镜活检和手术标本均经病理证实。男27例，女18例，年龄21-77岁（中位年龄52岁）。阳性对照为Raii细胞株，阴性对照为1例淋巴组织反应性增生。
1.2临床表现
45例胃肠道B-NHL患者中出现腹痛37例（82.2%），腹胀10例（22.2），血便10例（22.2%），发热8例（17.8%），腹部包块7例（15.6%），黑便6例（13.3%），消瘦5例（11.1%），黏液便5例（11.1%），腹泻2例（4.4%）。45例病变累及胃21例（46.7%），小肠2例（4.4%），回盲部3例（6.7%），结肠10例（22.2%），直肠3例（6.37%），小肠合并结肠1例（2.7%）。其中表现为淋巴结转移26例（57.8%），未查见淋巴结转移19例（42.3%）。
1.3方法
1.3.1免疫组化所有标本经中性福尔马林固定、常规石蜡包埋、4-5um连续组织切片，除进行常规HE染色以外，采用免疫组化S-P法进行免疫表型标记：LCA（2B11，DAKO）、CD3（F7.2.38，DAKO），CD45RO（OPD4，DAKO）、CD20（L26，DAKO）、CDIO（MX002，DAKO）、CDl5（Carb-3，DAKO）、CD30（Ber-2、DAKO）、Bcl-2（SP66，DAKO）、Bcl-6（LN22，DAKO）、CyclinD-1（DCS-6，DAKO）、PAX-5（SP34，DAKO）、kappalight chain（L1C1，DAKO）
和lambda light chain（LAM03+HP6054，DAKO）标记轻链。依据不同免疫表型表达情况并根据2008年WHO淋巴及造血系统肿瘤分类标准对所有病例进行分类。
1.3.2组织分型常规HE制片，结合免疫组化结果，所有病例经由2位以上病理学专家共同阅片确诊为非霍奇金B细胞淋巴瘤，其中胃肠道黏膜相关淋巴瘤（mucosa associated lymphoid tissuelymphoma，MALT）28例，弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）15例，滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）1例，套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）1例。
1.3.3DNA提取及半巢式PCR反应石蜡组织10um连续切片5张，常规酚一氯仿法抽提DNA。采用半巢式PCR。一致性v区引物（FR2A）：5’TGGA/GTC CGC/A CAG G/CCT/C T/CCN GG 3’一致性V区引物（FR3A）：5’ACA CGG C（C/T）（G/C）TGT ATT ACT GT 3’，（J区引物）LJH：5’TGAGGA GAC GGT GAC C 3’，（J区引物）VLJH：5’GTG ACC AGG GT（A/G/C/T）CCT TGG CCCCAG 3’。进行半巢式反应，第一轮PCR用引物FR3A（FR2A）+LJH，其产物稀释100倍作为模板，FR3A（FR2A）+VLJH进行第二轮PCR反应。总体积25uL：10×buffer 2.5uL，MgCl，1.8uL（终浓度1.8mM），dNTP 1.5uL（终浓度10uM），引物各0.2uL终浓度200nM），TaqPlus酶0.2uL（1u），模板DNA 1UL，体积不足部分双蒸水补足。所有PCR反应均在94℃预变性6min，94℃变性lmin，55℃退火lmin，72℃延伸lmin，40个循环，反应结束后在72℃延伸10min，然后4～C放置。产物长度70-130bp。已知阳性病例做阳性对照，反应性淋巴组织增生做阴性对照，缓冲液做空白对照。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳。所需引物和试剂均购自上海生工公司。 1.3.4结果判定与标准DNA分子量对照，在期待目的条带范围内出现1～2条特异性清晰条带为阳性，IgH FR2A的片段长度为230～270bp；IgH FR3A为80～120bp；并参照McCarthy提出的IgH基因重排阳性结果的4条判断标准：（1）电泳条带宽度不超过lmm，边缘整齐；（2）电泳产物在期望的大小范围内；（3）如背景上无涂抹带，亦无引物二聚体则是PCR扩增失败，而非阴性如果出现；（4）期望大小之外的其他条带，均为人工假象。
2.结果
2.1大体形态
溃疡型26例（57.8%），其中多发溃疡8例，巨大溃疡17例，浅表溃疡1例；结节型12例（26.7%）；结节溃疡型2例（4.4%）；弥漫浸润型5例（11.1%）。
2.2免疫组化结果
45例LCA（+）、42例CD20（+）、1例CD45RO灶（+）、44例CD45R0（-）、23例K（+）、18例入（+）。
2.3 IgH基因重排检测结果
IgH FR3A和IgH FR3A+FR2A在MALT淋巴瘤的阳性检测率分别是60.7%（17/28）和75.0%（21/28），在DLBCL中的阳性检测率分别是60.0%（9/15）和73.3%（11/15），在MCL中的阳性检测率分别是100.0%（1/1）和100.0%（1/1），在FL中的阳性检测率是0。IgH FR3A在胃肠道淋巴瘤中的阳性检测率是60.0%。IgH FR3A联合IgH FR2A中胃肠道淋巴瘤中的阳性检出率是73.3%。
3.讨论
首先表现为胃肠道受累的淋巴瘤称为原发性胃肠道淋巴瘤，原发性胃肠道术前诊断存在一定难度，x线钡餐图像和钡灌肠征象分别与胃癌和结肠癌之间不易区别。胃镜多表现为黏膜皱装明显增厚，呈现不规则隆起，可见结节状或广泛糜烂以及不规则溃疡等表现，多具有多形性、多灶性、弥漫性和假性愈合等特点。胃肠道恶性淋巴瘤确诊的关键依然依赖于病理学诊断，传统上依据HE常规染色切片联合免疫组织化学虽然能确诊大部分病例，但仍然有一部分病例由于其形态学和免疫组织化学的非典型性而造成误诊。
B淋巴细胞在分化过程中，位于14号染色体上的免疫球蛋白重链基因的可变区（V）、多样区（D）和连接区（J）要发生随机基因重排。由于重排的随机性以及重排片段连结区核苷酸的随机删除或插入等多样性使得每一克隆B淋巴细胞均具有自身的重排方式，由此产生了上万种不同免疫球蛋白。作为机体应对外界不良刺激，正常淋巴组织反应性增生产生多样的免疫球蛋白。恶性淋巴瘤是单克隆性增生，理论上所有的克隆表现为一种IgH基因重排。对Ig HV区进行基因重排检测，通常可判定克隆来源性质，判定单克隆和多克隆可明确病变性质。因此检测IgH基因的重排方式可作为确定细胞克隆起源。
目前临床最常用的基因重排检测引物设计是检测FRⅡ引物FR2A及针对FRⅢ引物FR3A，利用FR3A（FR2A）及JH引物主要扩增IgH V区的CDRⅢ，CDRⅢ是IgH V区变异程度最高的区域，使用FR3A（FR2A）引物，采用FR3A引物检测淋巴瘤的检测率为60.0%，联合FR2A本组研究PCR（FR2A+FR3A）在胃肠道B-NHL中IgH基因克隆性重排检测率可达73.3%左右与文献报道近似。
本研究检测45例NHL，IgH基因单克隆重排33例，检测率为73.3%，与文献报道近似。VH区基因突变程度的不同会引起FR引物与靶序列特定结合有效性产生一定差异；IgH基因不正确或不完全重排；有些样本中多克隆B细胞数量优势存在，导致无法检测出单克隆细胞；这些因素的存在皆可造成IgH基因克隆性重排检测出现假阴性结果。本组假阴性结果为12例，本组出现的假阴性结果可能原因为：（1）与FR3A DNA互补的片段可能缺失；（2）B细胞在恶性转变过程中可能发生突变，不能与引物发生反应；（3）单对引物不能检测恶性淋巴瘤分化过程中发生的形式多样的基因重排；（4）在单克隆性的肿瘤B细胞中出现一定数量的多克隆B细胞。假阴性结果的存在提示我们在分析基因重排检测结果时，阴性结果不能完全排除淋巴瘤的可能。
本组45例B-NHL的IgH基因重排检测琼脂糖凝胶电泳大部分为单一条带，2例出现二条重排带，出现这种结果的原因可能在于肿瘤中的两个等位基因同时发生了重排，还可能存在少数B细胞性克隆增生，由于克隆间存在一定差异，出现了一个或二个基因重排带。
PCR检测IgH重排对淋巴瘤的精准诊断具有一定的辅助作用，对一些疑难病例采用IgH基因重排检测帮助明确淋巴瘤的诊断，为临床提供正确的诊断，制定科学规范的治疗方案具有一定的帮助，对有条件开展基因重排检测的医院可考虑推广开展。