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氨基甲酸酯农药自上世纪五十年代商品化后，因其对多种害虫有良好的杀虫效果而被广泛用于粮食、蔬菜和水果等的农业生产，是目前使用量较大的杀虫剂之一。此外，氨基甲酸酯类化合物也作为杀虫剂用于工业，其它行业及家用产品。大多数氨基甲酸酯类农药在水中有较高溶解度，所以广泛分布于水环境中。同时，越来越多的证据表明此类化合物可以通过土壤淋溶和地表径流进入地下水和地表水，从而蔓延至整个生态系统。美国国家环保局（EPA）已将氨甲酸酯类农药列入优先控制污染名单。相关研究结果显示氨基甲酸酯类农药及其代谢产物是潜在的环境和食品污染物。随之，许多国家和地区对这类农药在食品中的残留制定了严格的限量标准，使得氨基甲酸酯类农药的分析检测技术备受关注。因此，建立一种简单，高效，灵敏的氨基甲酸酯类农药残留的分析方法具有重要意义。
目前，用于极性农药残留的主要检测手段是色谱技术，包括气相色谱（GC）和液相色谱（LC）。然而，由于氨基甲酸酯类农药自身的热不稳定性，GC直接检测此类化合物时将不可避免的损失部分目标物，从而降低方法的灵敏度。因此，通常氨基甲酸酯必须先通过衍生化反应转化为热稳定性衍生物，再进行分析测定。对于高沸点或稳定性差的化合物，高效液相色谱法则可以进行有效的分离检测，特别适合氨基甲酸酯类农药残留分析。
在食品分析检测中，由于样品基体的复杂性和极低的污染物含量，样品前处理是最复杂和耗时的步骤，通常占了整个分析过程的70%以上。一个有效的样品前处理技术是将痕量农药残留从复杂基质中提取的过程，同时也是一个富集，浓缩和净化的过程。不同种类的农药残留及其代谢产物主要根据其自身特性如极性，离子特性以及稳定性等选择相应的提取方式。迄今为止，氨基甲酸酯类农药残留的样品前处理技术有固相萃取（SPE），液液萃取（LLE），超临界萃取（SFE），加速溶剂萃取（ASE）以及固相微萃取（SPME）等。而SPE，LLE，SFE等萃取过程耗时耗力，萃取效率低；并且需要消耗大量有机溶剂，引起环境的二次污染。SPME是一种较新发展的样品前处理技术，全程不使用有机溶剂，在各领域已得到广泛应用。但它仍需解决与HPLC联用的接口技术问题。HF-SLME是1999年发展起来的一种新型样品前处理技术。它通过微量有机溶剂对目标分析物进行萃取同时，实现采样、分离、富集。该技术不仅操作简单，成本低廉，且具有较好的选择性和较高的富集倍数，能有效地解决溶剂残留问题，是一种环境友好的样品前处理技术。
本文将中空纤维支载液膜微萃取与HPLC/DAD联用技术成功应用于蔬菜样品中多种氨基甲酸酯农药残留的分析测定，通过对影响萃取效率的相关实验参数的优化，获得了较高的富集倍数，以及低于国家标准中的方法检出限。
实验部分
試剂与仪器。速灭威（metolcarb）、克百威（carbofuran）、甲萘威（carbaryl）和异丙威（isoprocarb）4种杀虫剂标准品（甲醇为溶剂，标准值100 μg/mL）购自农业部环境保护科研监测所。实验中所用有机试剂均为分析纯。甲醇为色谱纯购于Baker公司。实验用水为超纯水。聚丙烯中空纤维 Accurel Q3/2（孔径0.2 μm，内径600 μm，壁厚200 μm，孔率75%）和50/280聚丙烯中空纤维（内径280 μm，壁厚50 μm，孔径0.1 μm， 孔率60%）（德国Membrana GmbH公司）。1mL一次性无菌注射器为德国B.Braun公司制品，针头外径0.3 mm，长8 mm。
氨基甲酸酯标准溶液的配制：将1 mL 4种标准品全部转移入10 mL容量瓶，用甲醇分别定容，配制成10 μg/mL的标准储备液待用。使用时用甲醇进一步稀释。
色谱条件。安捷伦1260 Infinity HPLC系统包括G1315D DAD检测器和G1311B四元泵。色谱柱为Zorbax XDB-C18（250 mm × 4.6 mm × 5 μm）；流动相：甲醇-水，体积比60：40，流速1 mL/min下等度洗脱。检测波长：甲萘威220 nm，其余3种物质为200 nm。
HF-SLME萃取过程。HF-SLME萃取装置与作者之前发表的工作类似。现简述如下：将长约12 cm中空纤维用丙酮超声清洗，晾干备用；用水注满纤维内腔，将其浸入提前配制好的有机膜液5 min，使小孔内充满有机液体。取出中空纤维，用水将其内、外表面冲洗5次，以洗去残留在表面上的多余的有机液体。通过一次性注射器将接受相注入内腔直至充满，然后弯曲纤维成环状，将纤维两端用铝箔封裹后，直接浸没于样品溶液中进行振荡萃取。萃取结束后，取出纤维，去除封口铝箔，用注射器将约20 μL接受相吹出，取10 μL进HPLC/DAD分析测定。
样品制备。所有蔬菜样品均购于本地农贸市场。将新鲜蔬菜切成小块后放入食品搅拌机内进行充分匀浆。取20.0g匀浆放入50 mL离心管，5000 rpm转速离心10分钟，取上清液。用1 mL甲醇溶解沉淀物，涡旋震荡1min后离心，取出上清液。重复此过程两次。收集所有上清液，用超纯水定容至20 mL待用。
结果与讨论
中空纤维的选择。实验中选择Q3/2和PP50/280两种聚丙烯中空纤维作为液膜载体，考查其对萃取效率随时间变化的效应。实验初始条件供体相为20 mL，0.01M HCl溶液，加标50 μg/L；二己基醚（DHE）为有机液膜相。实验结果显示当Q3/2纤维作为液膜载体时4种化合物的富集倍数相对于PP50/280纤维来说要低2～3倍，其可能原因在于PP50/280中空纤维的比表面积比Q3/2要大，致使它对分析物的吸附量要高。因此，实验中选用PP50/280中空纤维作为液膜载体。
有机液膜的选择。在液相微萃取过程中，选择合适的有机溶液作为液膜相是影响萃取效率的一个至关重要的因素。预实验中比较了两种经典膜试剂：极性试剂二己基醚（DHE）和非极性试剂正十一烷（UND）对目标化合物的萃取效率。初步结果显示：DHE的萃取效率比UND至少高1/3，结果符合“相似相溶”原理，因此极性DHE更适合极性氨基甲酸酯类农药的萃取，但获得的富集倍数都较低。为了进一步提高富集倍数，分别在有机液膜中加入三辛基氧化膦（TOPO） 作为辅助萃取剂，进行考察。实验结果（Fig.1）表明：加入一定比例的TOPO后，萃取效率得到明显改善。其原因在于TOPO分子中的氧原子可与氨基甲酸酯化合物结构上的氨基氢形成氢键，从而增加了液膜的吸附能力。因此，实验选择DHE/TOPO混合溶剂作为萃取溶剂。 搅拌和振荡方式对萃取效率的影响。为了加速萃取中的传质过程，通常采用磁力搅拌和振荡两种不同运动方式来增加溶质分子的扩散速率。在实验中，分别对50，150，300 rpm三种不同速率的搅拌和振荡进行了比较。结果如Fig.2所示，在同等的实驗条件下，4种分析物的萃取效率在两种加速方式下都随着速度的增加而增加。相比较而言，振荡萃取获得的富集倍数（EFs： 35-52）和萃取稳定性（RSD%： 0.2-5.1%）比搅拌萃取要好（EFs：22-35； RSD%： 0.3-11.5%）。实验中发现：当300 rpm搅拌萃取时，样品溶液容易产生气泡，黏附在纤维壁上，阻碍分析物进入纤维孔中的液膜相，影响萃取的重现性。因此，实验选择300 rpm振荡方式加速萃取。
供体相和接受相pH值的选择。通过调节样品溶液pH值，可以使被萃取化合物在整个萃取过程中实现由样品溶液到接受相的单向流动，从而达到最大程度分离和富集目的。根据以上萃取原理，实验考查了供体相溶液在pH 2～9范围内萃取效率的变化。实验结果显示在低于pH 7条件下，萃取效率几乎不随pH变化而变化；大于pH 8时，萃取效率降低。这可能是由于氨基甲酸酯类农药在酸性条件下稳定存在，而在碱性条件下发生分解这一特性引起。同时由于常见果蔬的pH值在5.5-7.0之间，匀浆后的汁液呈弱酸性，所以在实际样品萃取过程无需调节pH值。
供体相离子强度的选择。对大多数萃取过程而言，通过盐析作用可以增加分析物在有机相中的分配系数，从而提高萃取效率。此外，有研究证明，适当增加样品溶液离子强度，可以抑制乳化现象的产生，增强液膜的稳定性。因此，实验中加入不同量的Na2SO4到样品溶液中，以考查盐浓度对此次萃取的影响。实验结果如图3所示，在Na2SO4浓度达到1 M之前，萃取效率随着Na2SO4浓度增加而提高，进一步增加盐浓度，萃取效率反而下降。产生这一现象的原因可能是萃取过程中，有两种效应的共同作用，即“盐析效应”和“静电效应”。在萃取初期，盐析作用占主导地位，样品中的氨基甲酸酯类农药尽可能多地从样品溶液中释放出来，进入到有机液膜相中。而随着盐浓度的增加，Na+和SO42-静电作用力加强，抑制萃取，最终导致萃取效率明显降低。所以，在以下的实验中加入1 M Na2SO4来提高萃取效率。
萃取时间的选择。中空纤维支载液膜微萃取（HF-SLME）是一种平衡萃取技术。在萃取过程中，增加萃取时间将使萃取进行得更为充分。一般情况下，在达到萃取平衡之前，随萃取时间增长，萃取效率将会增加。Fig.4所示实验结果表明：对于被分析的四种氨基甲酸酯类农药，当萃取时间为60 min时，萃取效率达到最大；随后，进一步增加萃取时间，萃取效率没有明显变化。因此，选用60 min作为适宜的萃取时间。
方法性能评价和实际应用。设计7个不同浓度水平的目标氨基甲酸酯类农药标准溶液，进行方法学评价，包括线性范围、相关系数、最低检测限及富集倍数。在所考察的浓度范围内，每种分析物的浓度与峰面积呈现良好的线性相关性（线性回归系数R > 0.99）。基于3倍信噪比（S/N = 3）得到甲萘威、异炳威、克百威和速灭威最低检测限分别为0.5，0.8，1.2和1.5 μg/L。平行测定5份5 μg/L氨基甲酸酯农残标准样品，相对标准偏差（RSDs）小于6%。
为一步评价本方法的实用性， 从市场购入番茄、芹菜、大白菜及菠菜四种蔬菜样品，用本文方法进行分析测定。结果显示，在所有外购的4种蔬菜样品中，均未检出目标氨基甲酸酯类农药残留。在实际样品中加入5 μg/L氨基甲酸酯类标准品获得的回收率为81 ～ 103%（RSD ≤6.2%），具体如表1所示。
结论
本研究建立了基于中空纤维支载液膜微萃取-HPLC/DAD联用测定蔬菜样品中四种氨基甲酸酯农药的分析检测方法。在辅助萃取剂TOPO的协同作用下，该方法获得较高的富集倍数，具有较好的重现性。在几种实际样品中，大部分虽未能检测到4种氨基甲酸酯类农药残留，但在实际样品中加入5 μg/L氨基甲酸酯标准品时，测得的加标回收率为81% ～ 103%。同时，本研究也证明了该方法对基质复杂的蔬菜样品有较好的净化作用和选择性，无需借助其它前处理手段，方便、快速，可以应用于各种基质复杂的样品检测。
基金项目：湖南省食品药品监督管理局---食品药品安全科技重点项目（湘食药科R2015015）。
（作者单位：陶 涌 毛谊平 沈银梅 任荣军 欧阳毅 湖南省岳阳市食品药品检验所；李鸿程 湖南省岳阳市环境监测中心）
目前，用于极性农药残留的主要检测手段是色谱技术，包括气相色谱（GC）和液相色谱（LC）。然而，由于氨基甲酸酯类农药自身的热不稳定性，GC直接检测此类化合物时将不可避免的损失部分目标物，从而降低方法的灵敏度。因此，通常氨基甲酸酯必须先通过衍生化反应转化为热稳定性衍生物，再进行分析测定。对于高沸点或稳定性差的化合物，高效液相色谱法则可以进行有效的分离检测，特别适合氨基甲酸酯类农药残留分析。
在食品分析检测中，由于样品基体的复杂性和极低的污染物含量，样品前处理是最复杂和耗时的步骤，通常占了整个分析过程的70%以上。一个有效的样品前处理技术是将痕量农药残留从复杂基质中提取的过程，同时也是一个富集，浓缩和净化的过程。不同种类的农药残留及其代谢产物主要根据其自身特性如极性，离子特性以及稳定性等选择相应的提取方式。迄今为止，氨基甲酸酯类农药残留的样品前处理技术有固相萃取（SPE），液液萃取（LLE），超临界萃取（SFE），加速溶剂萃取（ASE）以及固相微萃取（SPME）等。而SPE，LLE，SFE等萃取过程耗时耗力，萃取效率低；并且需要消耗大量有机溶剂，引起环境的二次污染。SPME是一种较新发展的样品前处理技术，全程不使用有机溶剂，在各领域已得到广泛应用。但它仍需解决与HPLC联用的接口技术问题。HF-SLME是1999年发展起来的一种新型样品前处理技术。它通过微量有机溶剂对目标分析物进行萃取同时，实现采样、分离、富集。该技术不仅操作简单，成本低廉，且具有较好的选择性和较高的富集倍数，能有效地解决溶剂残留问题，是一种环境友好的样品前处理技术。
本文将中空纤维支载液膜微萃取与HPLC/DAD联用技术成功应用于蔬菜样品中多种氨基甲酸酯农药残留的分析测定，通过对影响萃取效率的相关实验参数的优化，获得了较高的富集倍数，以及低于国家标准中的方法检出限。
实验部分
試剂与仪器。速灭威（metolcarb）、克百威（carbofuran）、甲萘威（carbaryl）和异丙威（isoprocarb）4种杀虫剂标准品（甲醇为溶剂，标准值100 μg/mL）购自农业部环境保护科研监测所。实验中所用有机试剂均为分析纯。甲醇为色谱纯购于Baker公司。实验用水为超纯水。聚丙烯中空纤维 Accurel Q3/2（孔径0.2 μm，内径600 μm，壁厚200 μm，孔率75%）和50/280聚丙烯中空纤维（内径280 μm，壁厚50 μm，孔径0.1 μm， 孔率60%）（德国Membrana GmbH公司）。1mL一次性无菌注射器为德国B.Braun公司制品，针头外径0.3 mm，长8 mm。
氨基甲酸酯标准溶液的配制：将1 mL 4种标准品全部转移入10 mL容量瓶，用甲醇分别定容，配制成10 μg/mL的标准储备液待用。使用时用甲醇进一步稀释。
色谱条件。安捷伦1260 Infinity HPLC系统包括G1315D DAD检测器和G1311B四元泵。色谱柱为Zorbax XDB-C18（250 mm × 4.6 mm × 5 μm）；流动相：甲醇-水，体积比60：40，流速1 mL/min下等度洗脱。检测波长：甲萘威220 nm，其余3种物质为200 nm。
HF-SLME萃取过程。HF-SLME萃取装置与作者之前发表的工作类似。现简述如下：将长约12 cm中空纤维用丙酮超声清洗，晾干备用；用水注满纤维内腔，将其浸入提前配制好的有机膜液5 min，使小孔内充满有机液体。取出中空纤维，用水将其内、外表面冲洗5次，以洗去残留在表面上的多余的有机液体。通过一次性注射器将接受相注入内腔直至充满，然后弯曲纤维成环状，将纤维两端用铝箔封裹后，直接浸没于样品溶液中进行振荡萃取。萃取结束后，取出纤维，去除封口铝箔，用注射器将约20 μL接受相吹出，取10 μL进HPLC/DAD分析测定。
样品制备。所有蔬菜样品均购于本地农贸市场。将新鲜蔬菜切成小块后放入食品搅拌机内进行充分匀浆。取20.0g匀浆放入50 mL离心管，5000 rpm转速离心10分钟，取上清液。用1 mL甲醇溶解沉淀物，涡旋震荡1min后离心，取出上清液。重复此过程两次。收集所有上清液，用超纯水定容至20 mL待用。
结果与讨论
中空纤维的选择。实验中选择Q3/2和PP50/280两种聚丙烯中空纤维作为液膜载体，考查其对萃取效率随时间变化的效应。实验初始条件供体相为20 mL，0.01M HCl溶液，加标50 μg/L；二己基醚（DHE）为有机液膜相。实验结果显示当Q3/2纤维作为液膜载体时4种化合物的富集倍数相对于PP50/280纤维来说要低2～3倍，其可能原因在于PP50/280中空纤维的比表面积比Q3/2要大，致使它对分析物的吸附量要高。因此，实验中选用PP50/280中空纤维作为液膜载体。
有机液膜的选择。在液相微萃取过程中，选择合适的有机溶液作为液膜相是影响萃取效率的一个至关重要的因素。预实验中比较了两种经典膜试剂：极性试剂二己基醚（DHE）和非极性试剂正十一烷（UND）对目标化合物的萃取效率。初步结果显示：DHE的萃取效率比UND至少高1/3，结果符合“相似相溶”原理，因此极性DHE更适合极性氨基甲酸酯类农药的萃取，但获得的富集倍数都较低。为了进一步提高富集倍数，分别在有机液膜中加入三辛基氧化膦（TOPO） 作为辅助萃取剂，进行考察。实验结果（Fig.1）表明：加入一定比例的TOPO后，萃取效率得到明显改善。其原因在于TOPO分子中的氧原子可与氨基甲酸酯化合物结构上的氨基氢形成氢键，从而增加了液膜的吸附能力。因此，实验选择DHE/TOPO混合溶剂作为萃取溶剂。 搅拌和振荡方式对萃取效率的影响。为了加速萃取中的传质过程，通常采用磁力搅拌和振荡两种不同运动方式来增加溶质分子的扩散速率。在实验中，分别对50，150，300 rpm三种不同速率的搅拌和振荡进行了比较。结果如Fig.2所示，在同等的实驗条件下，4种分析物的萃取效率在两种加速方式下都随着速度的增加而增加。相比较而言，振荡萃取获得的富集倍数（EFs： 35-52）和萃取稳定性（RSD%： 0.2-5.1%）比搅拌萃取要好（EFs：22-35； RSD%： 0.3-11.5%）。实验中发现：当300 rpm搅拌萃取时，样品溶液容易产生气泡，黏附在纤维壁上，阻碍分析物进入纤维孔中的液膜相，影响萃取的重现性。因此，实验选择300 rpm振荡方式加速萃取。
供体相和接受相pH值的选择。通过调节样品溶液pH值，可以使被萃取化合物在整个萃取过程中实现由样品溶液到接受相的单向流动，从而达到最大程度分离和富集目的。根据以上萃取原理，实验考查了供体相溶液在pH 2～9范围内萃取效率的变化。实验结果显示在低于pH 7条件下，萃取效率几乎不随pH变化而变化；大于pH 8时，萃取效率降低。这可能是由于氨基甲酸酯类农药在酸性条件下稳定存在，而在碱性条件下发生分解这一特性引起。同时由于常见果蔬的pH值在5.5-7.0之间，匀浆后的汁液呈弱酸性，所以在实际样品萃取过程无需调节pH值。
供体相离子强度的选择。对大多数萃取过程而言，通过盐析作用可以增加分析物在有机相中的分配系数，从而提高萃取效率。此外，有研究证明，适当增加样品溶液离子强度，可以抑制乳化现象的产生，增强液膜的稳定性。因此，实验中加入不同量的Na2SO4到样品溶液中，以考查盐浓度对此次萃取的影响。实验结果如图3所示，在Na2SO4浓度达到1 M之前，萃取效率随着Na2SO4浓度增加而提高，进一步增加盐浓度，萃取效率反而下降。产生这一现象的原因可能是萃取过程中，有两种效应的共同作用，即“盐析效应”和“静电效应”。在萃取初期，盐析作用占主导地位，样品中的氨基甲酸酯类农药尽可能多地从样品溶液中释放出来，进入到有机液膜相中。而随着盐浓度的增加，Na+和SO42-静电作用力加强，抑制萃取，最终导致萃取效率明显降低。所以，在以下的实验中加入1 M Na2SO4来提高萃取效率。
萃取时间的选择。中空纤维支载液膜微萃取（HF-SLME）是一种平衡萃取技术。在萃取过程中，增加萃取时间将使萃取进行得更为充分。一般情况下，在达到萃取平衡之前，随萃取时间增长，萃取效率将会增加。Fig.4所示实验结果表明：对于被分析的四种氨基甲酸酯类农药，当萃取时间为60 min时，萃取效率达到最大；随后，进一步增加萃取时间，萃取效率没有明显变化。因此，选用60 min作为适宜的萃取时间。
方法性能评价和实际应用。设计7个不同浓度水平的目标氨基甲酸酯类农药标准溶液，进行方法学评价，包括线性范围、相关系数、最低检测限及富集倍数。在所考察的浓度范围内，每种分析物的浓度与峰面积呈现良好的线性相关性（线性回归系数R > 0.99）。基于3倍信噪比（S/N = 3）得到甲萘威、异炳威、克百威和速灭威最低检测限分别为0.5，0.8，1.2和1.5 μg/L。平行测定5份5 μg/L氨基甲酸酯农残标准样品，相对标准偏差（RSDs）小于6%。
为一步评价本方法的实用性， 从市场购入番茄、芹菜、大白菜及菠菜四种蔬菜样品，用本文方法进行分析测定。结果显示，在所有外购的4种蔬菜样品中，均未检出目标氨基甲酸酯类农药残留。在实际样品中加入5 μg/L氨基甲酸酯类标准品获得的回收率为81 ～ 103%（RSD ≤6.2%），具体如表1所示。
结论
本研究建立了基于中空纤维支载液膜微萃取-HPLC/DAD联用测定蔬菜样品中四种氨基甲酸酯农药的分析检测方法。在辅助萃取剂TOPO的协同作用下，该方法获得较高的富集倍数，具有较好的重现性。在几种实际样品中，大部分虽未能检测到4种氨基甲酸酯类农药残留，但在实际样品中加入5 μg/L氨基甲酸酯标准品时，测得的加标回收率为81% ～ 103%。同时，本研究也证明了该方法对基质复杂的蔬菜样品有较好的净化作用和选择性，无需借助其它前处理手段，方便、快速，可以应用于各种基质复杂的样品检测。
基金项目：湖南省食品药品监督管理局---食品药品安全科技重点项目（湘食药科R2015015）。
（作者单位：陶 涌 毛谊平 沈银梅 任荣军 欧阳毅 湖南省岳阳市食品药品检验所；李鸿程 湖南省岳阳市环境监测中心）