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【摘 要】 目的 观察玻璃体腔内注射促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）对早期糖尿病大叟视网膜神经元凋亡的保护作用，初步探讨其可能的作用机制。方法 45只大鼠随机分为空白对照组（n=15）、对照组（n=15）和实验组（n=15）三组，对照组和实验组STZ法建糖尿病动物模型，对照组玻璃体腔内注射5μL生理盐水，实验组玻璃体腔内注射EPO200ng，透视电镜视网膜神经节的形态变化、RT-PCR法观察NF-κB、survivin、Capase-3和PKAmRNA的表达，WB法检测BAX、Bcl-2、Capase-3原型、Capase-3激活型等蛋白的表达。结果 ①和空白对照组相比，对照组视网膜神经节细胞表现为核固缩，核染色加深，大量线粒体空泡，线粒体嵴消失，实验组视神经节细胞表现明显好于对照组。② 和对照组相比，实验组NF-κb和survivinmRNA表达增多（p<0.05），Caspase-3和PKAmRNA表达降低（p<0.05）。③和对照组相比，实验组Bax和Caspase-3激活型蛋白表达降低（p<0.05），Bcl-2和Caspase-3原型蛋白表达增高（p<0.05）。结果 EPO可降低早期糖尿病大鼠的视网膜神经节细胞损伤，可能是通过增强抑制凋亡因子和抑制凋亡因子等的表达发挥保护作用。
【关键词】 促红细胞生成素 糖尿病视网膜病变 凋亡
1 资料与方法
1.1 实验动物选择 选45只SD大鼠，体重200～250g，随机分为空白对照组（n=15，不进行任何治疗）、对照组（n=15，玻璃体腔内注射生理盐水）、实验组（n=15，玻璃体腔内注射EPO）。
1.2 模型建立：对照组和实验组30只进行实验动物建模，采用链-脲佐菌素（Streptozotocin， STZ）一次性60mg/kg尾静脉注射制作糖尿病模型，给药后24h及1周清晨采尾静脉血测血糖，2次检测血糖均高于16.7mmol/L且有多饮、多食、多尿等症状者确定为糖尿病大鼠。
1.3 注射方法 实验组采用水合氯醛腹腔深度麻醉，手术显微镜视野下，用10μL微量加样器抽取EPO200ng（用生理盐水稀释至40ng/μL，注射5μL），以颞上方角巩膜缘后1mm处作为进针点，以45°～50°角度进入眼内，通过瞳孔直视针尖，确认到达玻璃体腔中央部后缓慢注入药液，停留15s后拔针。灭菌玻璃压迫针孔10s防止因眼压升高导致药液溢出。注射完成后用氧氟沙星眼膏点眼。对照组采用同样方法注射5微升生理盐水。每周治疗3次，2周后进行检测。
1.4 电镜标本处理 每组取5只大鼠，腹腔麻醉后，动脉插管，经NS250ml和2%多聚甲醛+2.5%的戊二醛混合液250mL灌注固定后，取眼球，剥离视网膜。取视网膜组织经戊二醛固定、PBS漂洗、乙醇脱水、丙酮脱水、Epon618环氧树脂包埋，定位后制备超薄切片，采用醋酸铅铀和酸铅双重染色，透视电镜下观察神经元和突触。
1.5 PCR检测NF-κB、survivin、capase-3和PKA mRNA的表达 每组取5只大鼠，断头法处死后摘取眼球剥离视网膜，经过按Trizol试剂盒要求提取总RNA、按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行合成cDNA、PCR扩增等步骤后，取扩增PCR产物加入到1.5%非变性琼脂糖凝胶（含核酸染料）中，在140V电压的条件下电泳约30min，采用凝胶电泳成像分析系统扫描获取电泳图像，紫外线照射，可见相应长度的扩增条带，采用Image Lab软件进行分析，以NF-kB、surviving、Caspase-3、PKA条带的灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值反应NF-kB、survivin、Caspase-3。PKA mRNA的表达水平。
1.6 Western blot法检测 Bax和Bcl-2蛋白的表达 每组取5只大鼠，断头法处死，立即摘取眼球，剥离视网膜后，经提取组织蛋白、制作SDS-PAGE凝胶、蛋白槽式湿转、封闭标记抗体及曝光等步骤，用凝胶电泳成像分析系统扫描制成的X光片，红外线照射可见目的条带， Quantity One 5.0进行分析，采用Bax、Bd-2条带的灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值表示Bax、Bcl-2蛋白的相对量。
1.7统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量资料以（x ± S）表示，采用单因素方差检验，以p<0.05为有统计差异。
2 结果
2.1 电镜分析结果
空白对照组（正常大鼠）：正常视网膜神经节细胞表现为核染色均匀居中，染色质颜色清晰，周围散落正常形态的线粒体、内质网等细胞器，细胞膜完整。实验组（糖尿病建模后玻璃体腔注射EPO）：视网膜神经节细胞表现为细胞核染色均匀，周围的线粒体出现少量空泡，内质网稍肿胀，细胞膜完整。对照组（糖尿病建模后玻璃体腔注射生理盐水）：视网膜神经节细胞表现为核固缩，核染色加深，大量线粒体空泡，线粒体嵴消失。
2.2 PCR结果
半定量分析结果对比见表1。
2.3 WB法检测结果
半定量分析结果见表2。
3 讨论
许多研究证明，EPO具有神经保护作用，其可能的作用机制是通过对体液因子的调节而达到保护的目的。
本研究表明，糖尿病大鼠中抗凋亡因子Survivn mRNA表达降低，Caspase-3mRNA和PKA mRNA等凋亡因子表达增加，提示糖尿病可导致视网膜神经病节细胞凋亡；EPO可提升NF-κBmRNA和SuvivinmRNA两种抗凋亡因子水平，降低Caspase-3mRNA和PKAmRNA两种凋亡因子的水平，从而保护糖尿病大鼠视网膜。
本研究还表明，糖尿病大鼠中，BAX蛋白、Bcl-2蛋白、Caspase-3激活型蛋白等凋亡因子增加，抗凋亡因子Caspase-3原型蛋白降低，同样提示糖尿病可诱导视网膜神经节细胞凋亡；EPO可降低BAX蛋白、Bcl-2蛋白、Caspase-3激活型蛋白等凋亡因子水平，增加抗凋亡因子Caspase-3原型蛋白水平，发挥抗凋亡作用。
综上所述，玻璃体腔内注射EPO可降低早期糖尿病大鼠的视网膜神经节细胞损伤，可能是通过增强抑制凋亡因子和抑制凋亡因子等的表达发挥保护作用。
【关键词】 促红细胞生成素 糖尿病视网膜病变 凋亡
1 资料与方法
1.1 实验动物选择 选45只SD大鼠，体重200～250g，随机分为空白对照组（n=15，不进行任何治疗）、对照组（n=15，玻璃体腔内注射生理盐水）、实验组（n=15，玻璃体腔内注射EPO）。
1.2 模型建立：对照组和实验组30只进行实验动物建模，采用链-脲佐菌素（Streptozotocin， STZ）一次性60mg/kg尾静脉注射制作糖尿病模型，给药后24h及1周清晨采尾静脉血测血糖，2次检测血糖均高于16.7mmol/L且有多饮、多食、多尿等症状者确定为糖尿病大鼠。
1.3 注射方法 实验组采用水合氯醛腹腔深度麻醉，手术显微镜视野下，用10μL微量加样器抽取EPO200ng（用生理盐水稀释至40ng/μL，注射5μL），以颞上方角巩膜缘后1mm处作为进针点，以45°～50°角度进入眼内，通过瞳孔直视针尖，确认到达玻璃体腔中央部后缓慢注入药液，停留15s后拔针。灭菌玻璃压迫针孔10s防止因眼压升高导致药液溢出。注射完成后用氧氟沙星眼膏点眼。对照组采用同样方法注射5微升生理盐水。每周治疗3次，2周后进行检测。
1.4 电镜标本处理 每组取5只大鼠，腹腔麻醉后，动脉插管，经NS250ml和2%多聚甲醛+2.5%的戊二醛混合液250mL灌注固定后，取眼球，剥离视网膜。取视网膜组织经戊二醛固定、PBS漂洗、乙醇脱水、丙酮脱水、Epon618环氧树脂包埋，定位后制备超薄切片，采用醋酸铅铀和酸铅双重染色，透视电镜下观察神经元和突触。
1.5 PCR检测NF-κB、survivin、capase-3和PKA mRNA的表达 每组取5只大鼠，断头法处死后摘取眼球剥离视网膜，经过按Trizol试剂盒要求提取总RNA、按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行合成cDNA、PCR扩增等步骤后，取扩增PCR产物加入到1.5%非变性琼脂糖凝胶（含核酸染料）中，在140V电压的条件下电泳约30min，采用凝胶电泳成像分析系统扫描获取电泳图像，紫外线照射，可见相应长度的扩增条带，采用Image Lab软件进行分析，以NF-kB、surviving、Caspase-3、PKA条带的灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值反应NF-kB、survivin、Caspase-3。PKA mRNA的表达水平。
1.6 Western blot法检测 Bax和Bcl-2蛋白的表达 每组取5只大鼠，断头法处死，立即摘取眼球，剥离视网膜后，经提取组织蛋白、制作SDS-PAGE凝胶、蛋白槽式湿转、封闭标记抗体及曝光等步骤，用凝胶电泳成像分析系统扫描制成的X光片，红外线照射可见目的条带， Quantity One 5.0进行分析，采用Bax、Bd-2条带的灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值表示Bax、Bcl-2蛋白的相对量。
1.7统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量资料以（x ± S）表示，采用单因素方差检验，以p<0.05为有统计差异。
2 结果
2.1 电镜分析结果
空白对照组（正常大鼠）：正常视网膜神经节细胞表现为核染色均匀居中，染色质颜色清晰，周围散落正常形态的线粒体、内质网等细胞器，细胞膜完整。实验组（糖尿病建模后玻璃体腔注射EPO）：视网膜神经节细胞表现为细胞核染色均匀，周围的线粒体出现少量空泡，内质网稍肿胀，细胞膜完整。对照组（糖尿病建模后玻璃体腔注射生理盐水）：视网膜神经节细胞表现为核固缩，核染色加深，大量线粒体空泡，线粒体嵴消失。
2.2 PCR结果
半定量分析结果对比见表1。
2.3 WB法检测结果
半定量分析结果见表2。
3 讨论
许多研究证明，EPO具有神经保护作用，其可能的作用机制是通过对体液因子的调节而达到保护的目的。
本研究表明，糖尿病大鼠中抗凋亡因子Survivn mRNA表达降低，Caspase-3mRNA和PKA mRNA等凋亡因子表达增加，提示糖尿病可导致视网膜神经病节细胞凋亡；EPO可提升NF-κBmRNA和SuvivinmRNA两种抗凋亡因子水平，降低Caspase-3mRNA和PKAmRNA两种凋亡因子的水平，从而保护糖尿病大鼠视网膜。
本研究还表明，糖尿病大鼠中，BAX蛋白、Bcl-2蛋白、Caspase-3激活型蛋白等凋亡因子增加，抗凋亡因子Caspase-3原型蛋白降低，同样提示糖尿病可诱导视网膜神经节细胞凋亡；EPO可降低BAX蛋白、Bcl-2蛋白、Caspase-3激活型蛋白等凋亡因子水平，增加抗凋亡因子Caspase-3原型蛋白水平，发挥抗凋亡作用。
综上所述，玻璃体腔内注射EPO可降低早期糖尿病大鼠的视网膜神经节细胞损伤，可能是通过增强抑制凋亡因子和抑制凋亡因子等的表达发挥保护作用。