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【摘要】采用半静态实验方法，设置不同温度和Cd2+浓度对黑鲷进行96h急性试验，测定其肝脏内SOD和CAT活性的变化。试验结果表明，单一温度试验组SOD活性随温度升高表现为先上升再下降再回升的趋势，26℃处SOD活性最高；CAT活性随温度升高表现为先上升后下降的趋势，29℃处达到最大值；0.5mg/L Cd2+浓度组SOD和CAT活性随温度上升都表现为先上升再下降的趋势，最高值出现在26℃处；5.0 mg/L Cd2+浓度组SOD活性值随温度升高表现为先上升再下降再回升的趋势，最高值出现在26℃处，CAT活性随温度升高表现为先上升再下降的趋势，在26℃达到最高值。
【关键词】温度；重金属(Cd2+)；黑鲷；超氧化物歧化酶(SOD)；过氧化氢酶(CAT)
随着废水排放量的增加，我国水域环境污染日趋严重，这给水生生物的生存环境造成了严重的影响。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)和超氧化氢酶(Catalase，简称CAT)是水生生物抗氧化酶系统的重要组成成分，抗氧化防御系统的一个重要特征是其活性可由于污染的胁迫而发生改变，因而，可间接反映环境中氧化污染的存在，可作为环境污染胁迫的指标[1-8]。镉(Cd)是水体重金属污染的主要元素之一，温度是水环境污染的四大因子之一，对这两种因子的研究已有不少报道，如贾秀英等研究了镉对鲫鱼（Carassias Auratus）转胺酶和抗氧化还原酶的影响[9-10]，赵元凤等研究了镉污染对鲢鱼SOD和CAT活性的影响[11]，李希国等研究了温度对对黄鳍鲷（Sparus latus）主要消化酶活性的影响[12]等等，这些研究主要偏重于单一的重金属或者温度因子对水生生物的影响，而实际环境中往往是多种污染因子共存，为此本文选取了黑鲷(Sparus macrocephalus)为材料，研究了不同浓度的Cd和温度复合污染对黑鲷肝脏组织内SOD、CAT活性的影响，探讨以SOD、CAT活性变化作为污染生化指标的可能性，并为抗氧化防御系统的毒理学研究提供基础资料。
1.材料和方法
1.1 仪器与试剂
7230G可见分光光度计（上海精密科仪有限公司）；微量移液器(Finnpipette);
电热数字显示恒温水浴锅（上海浦东跃欣科学仪器厂）；TGLl6G型台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)等。CdCl2（A.R）为上海化学试剂厂生产。配制成浓度为1000mg/L的母液，再据需要稀释成各浓度。CAT试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.2 材料
受试鱼类：黑鲷取自象山港人工育苗厂，平均体长8.23±0.14cm，平均全长10.04±0.11cm，平均体重14.83±0.80g，试验前暂养48小时以上，选择正常、健康、活力强，大小均匀的个体投入试验。
1.3 试验方法
1.3.1 试验设计
采用半静态试验方式，选用体积为35×50×70cm的水槽，每个水槽放海水40L，水温由导电温控装置控制，控制精度为±0.2℃。试验过程中连续冲氧，按照各组试验浓度每天更换1/3试验溶液。每一组投放10尾黑鲷，试验过程中不投饵。共分为三个试验方式：在空白海水中、在0.5mg/LCd2+溶液中及在5.0mg/L Cd2+溶液中设定不同温度，梯度设定如表1所示。
各试验组设平行样一个，对黑鲷进行96h实验，在96h后在每组分别取4尾鱼，取出肝脏分别测定其SOD和CAT的活性。
1.3.2 酶活性的测定
SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定，其活性单位定义为：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为—个单位。CAT采用可见光法测定，其活性单位定义为：每毫克组织蛋白每秒钟分解1µmol的H2O2的量为一个活力单位。
1.4 试验条件
试验用海水取自象山港海区过滤水，盐度为23.5-25.0，pH为8.05-8.20，溶解氧在8.0mg/L以上。白天8:00,10:00,15:00和17:00的平均光照强度分别是680lx,1250lx,320lx和180lx。
1.5 试验地点和时间
试验地点选择浙江省象山港海区，试验时间为2005年9月。
1.6 数据处理与分析
实验结果使用SPSS统计软件和单边DUNCAN法对各组数据进行差异性显著分析．不同处理因子与SOD和CAT活性关系利用EXEL软件进行分析。
2.结果
如图1所示，空白海水组试验96h后，黑鲷肝脏的SOD活性变化趋势是先上升，在26℃处达到最高值，随后开始下降，直到29℃处降到最低值，而后又有小幅回升直到32℃。通过对各处理组中黑鲷SOD活性大小进行DUNCAN方差分析，差异性结果如表2中所示，26℃处的SOD活性明显受到诱導作用；0.5mg/L Cd2+溶液组试验96h后，黑鲷的肝脏中的SOD活性变化趋势是先略为上升,在26℃处达到最高值，随后开始下降，32℃处降到最低值。DUNCAN分析结果如表2所示，各组间差异不显著；温度与5.0 mg/L Cd2+处理96h后，黑鲷的肝脏中的SOD活性变化趋势是先上升，在26℃处达到最高值，随后开始下降到29℃，之后再回升。DUNCAN分析结果如表2所示，26℃处的SOD活性受到显著诱导作用。
由图2分析可知，空白海水试验96h后，黑鲷肝脏的CAT活性变化趋势是先上升后下降，在29℃处达到最高值，随后的32℃组的CAT活性迅速下降。由表2中的DUNCAN分析结果可知，29℃处CAT活性受到显著诱导；0.5mg/LCd2+溶液中试验96h后，黑鲷的肝脏中的CAT活性变化趋势是先上升,在26℃处达到最高值，随后开始下降，32℃处降到最低值。DUNCAN分析结果如表2所示，26℃处CAT活性明显受到诱导；5.0mg/L Cd2+溶液试验96h后，黑鲷的肝脏中的CAT活性变化趋势也是先上升，在26℃处达到最高值，随后开始下降直到32℃处降到最低。DUNCAN分析结果如表2所示，26℃处CAT的活性明显受到诱导作用。
3.讨论
3.1 抗氧化防御系统与Cd2+毒性机理
抗氧化防御系统是需氧生物体内重要的活性氧清除系统，主要包括酶性清除剂抗氧化酶，如SOD、CAT、GPx等，以及小分子抗氧化剂，如GSH、维生素c、维生素E等。在正常生理条件下，动物体内代谢产生的活性氧可被抗氧化防御系统有效清除。但当机体暴露于可产生氧化还原污染的污染物时，若活性氧的产生速度超出了机体抗氧化防御系统的清除能力，就会对机体造成氧化胁迫，从而引发一系列毒性效应，如脂质过氧化、DNA损伤、酶失活、甚至细胞死亡或癌变。早有研究报道，生物体内抗氧化成分会因污染胁迫的存在而改变[3]。
大量实验研究表明，动物的重金属中毒效应主要体现在自由基介导的氧化损伤。一方面，镉通过多种途径在体内诱发产生大量的自由基代谢物、活性氧。另一方面，镉也可以作用于细胞的抗氧化酶系统，降低细胞对氧自由基的清除能力。通过两方面的作用使体内产生大量氧自由基。而自由基及其反应产物往往可以通过夺氢、氧化巯基、破坏碳链等反应而使包括DNA在内的各种生物大分子结构和性质发生改变，进而导致各种病变，也可使不饱和脂肪酸过氧化，分解成丙二醛等物质，使生物大分子之间发生交联，聚合成异常的大分子，进而造成膜损伤，或降低膜的流动性，从而影响膜上或膜周围的对细胞增殖或凋亡有重要调节作用的酶。细胞内的CAT主要存在于过氧化物体内，在外源因子胁迫下细胞膜受到损伤，膜透性增加，从而导致CAT活性下降，与此同时，细胞内H202的水平保持稳定或增加。当外源因子胁迫程度较轻时，反而会使CAT活性增高，这可能是动物体内细胞防止活性氧伤害的一种保护反应。CAT是一种含Fe的金属酶，主要作用是催化H202分解成H20与O2- [3]。
3.2结果讨论
如图1中所示，各组黑鲷SOD活性变化规律性一般，但总体上看三条曲线，可以看出升温和Cd2+污染对黑鲷SOD活性变化有协同作用，复合处理后其活性水平明显比单一升温处理组要高，说明升温和Cd2+污染彼此加强了对黑鲷的SOD活性影响，毒理兴奋效应有所增强。
由图2可知，各组黑鲷CAT活性变化规律性比较强，三条曲线中黑鲷CAT活性都是随温度的升高先上升后下降的趋势，表明黑鲷在受到外界升温刺激后，体内活性氧自由基增多，从而诱导CAT等酶的水平升高，来消除自由基；在温度继续升高时，超过了黑鲷机体的自我调节能力，从而破坏了抗氧化还原系统，抑制了CAT的活性，导致其活性值下降。对比三条曲线可得各处理组CAT平均值大小为：0.5mg/L Cd2组>5.0 mg/L Cd2组>空白海水组，这是由于Cd2+污染与升温处理相互协同作用，使其毒性增强诱导CAT水平升高所致；而0.5mg/L Cd2处理组>5.0mg/L Cd2处理组，又说明相同条件下，低浓度复合处理比高浓度复合处理对CAT的诱导程度更大。
由圖1和2分析讨论的结果可得：升温与Cd2+污染复合处理对黑鲷肝脏SOD和CAT活性的毒性刺激，相比单一升温处理有所增强；SOD与CAT灵敏的反应出环境的变化情况，可用其作为氧化胁迫的生物生理指标，用来检测评估环境污染的状况。
参考文献
[1]徐立红，张甬元，陈宜瑜．分子生态毒理学研究进展及其在水环境保护中的意义[J].水生生物学报，1995，9(2)：171-185．
[2]Rainbow P S．海洋生物对重金属的积累及意义[J].海洋环境科学，1992，11(1)：44-51
[3]方允中，李文杰．自由基与酶基础理论及其在生物学和医学上的应用[M].北京，科学出版社，1989.
129-146
[4]郝志明，吴燕燕，李来好.罗非鱼内脏中酶的筛选[J].南方水产，2006，2(2)：38-42．
[5]李永祺，丁美丽。海洋污染生物学[M].北京：海洋出版社，1991，277－305．
[6]周永欣，章宗涉．水生生物毒性试验方法论[M].北京：农业出版社．1989．
[7]王晓伟，李纯厚，沈南南.石油污染对海洋生物的影响[J].南方水产，2006，2(2)：76-80．
基金项目：农业部海洋与河口渔业重点开放实验室开放基金资助（开－1－04－05）。
作者简介：谢汉阳，男，浙江象山人，在职研究生，主要从事渔业水域环境评价与保护研究。
【关键词】温度；重金属(Cd2+)；黑鲷；超氧化物歧化酶(SOD)；过氧化氢酶(CAT)
随着废水排放量的增加，我国水域环境污染日趋严重，这给水生生物的生存环境造成了严重的影响。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)和超氧化氢酶(Catalase，简称CAT)是水生生物抗氧化酶系统的重要组成成分，抗氧化防御系统的一个重要特征是其活性可由于污染的胁迫而发生改变，因而，可间接反映环境中氧化污染的存在，可作为环境污染胁迫的指标[1-8]。镉(Cd)是水体重金属污染的主要元素之一，温度是水环境污染的四大因子之一，对这两种因子的研究已有不少报道，如贾秀英等研究了镉对鲫鱼（Carassias Auratus）转胺酶和抗氧化还原酶的影响[9-10]，赵元凤等研究了镉污染对鲢鱼SOD和CAT活性的影响[11]，李希国等研究了温度对对黄鳍鲷（Sparus latus）主要消化酶活性的影响[12]等等，这些研究主要偏重于单一的重金属或者温度因子对水生生物的影响，而实际环境中往往是多种污染因子共存，为此本文选取了黑鲷(Sparus macrocephalus)为材料，研究了不同浓度的Cd和温度复合污染对黑鲷肝脏组织内SOD、CAT活性的影响，探讨以SOD、CAT活性变化作为污染生化指标的可能性，并为抗氧化防御系统的毒理学研究提供基础资料。
1.材料和方法
1.1 仪器与试剂
7230G可见分光光度计（上海精密科仪有限公司）；微量移液器(Finnpipette);
电热数字显示恒温水浴锅（上海浦东跃欣科学仪器厂）；TGLl6G型台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)等。CdCl2（A.R）为上海化学试剂厂生产。配制成浓度为1000mg/L的母液，再据需要稀释成各浓度。CAT试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.2 材料
受试鱼类：黑鲷取自象山港人工育苗厂，平均体长8.23±0.14cm，平均全长10.04±0.11cm，平均体重14.83±0.80g，试验前暂养48小时以上，选择正常、健康、活力强，大小均匀的个体投入试验。
1.3 试验方法
1.3.1 试验设计
采用半静态试验方式，选用体积为35×50×70cm的水槽，每个水槽放海水40L，水温由导电温控装置控制，控制精度为±0.2℃。试验过程中连续冲氧，按照各组试验浓度每天更换1/3试验溶液。每一组投放10尾黑鲷，试验过程中不投饵。共分为三个试验方式：在空白海水中、在0.5mg/LCd2+溶液中及在5.0mg/L Cd2+溶液中设定不同温度，梯度设定如表1所示。
各试验组设平行样一个，对黑鲷进行96h实验，在96h后在每组分别取4尾鱼，取出肝脏分别测定其SOD和CAT的活性。
1.3.2 酶活性的测定
SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定，其活性单位定义为：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为—个单位。CAT采用可见光法测定，其活性单位定义为：每毫克组织蛋白每秒钟分解1µmol的H2O2的量为一个活力单位。
1.4 试验条件
试验用海水取自象山港海区过滤水，盐度为23.5-25.0，pH为8.05-8.20，溶解氧在8.0mg/L以上。白天8:00,10:00,15:00和17:00的平均光照强度分别是680lx,1250lx,320lx和180lx。
1.5 试验地点和时间
试验地点选择浙江省象山港海区，试验时间为2005年9月。
1.6 数据处理与分析
实验结果使用SPSS统计软件和单边DUNCAN法对各组数据进行差异性显著分析．不同处理因子与SOD和CAT活性关系利用EXEL软件进行分析。
2.结果
如图1所示，空白海水组试验96h后，黑鲷肝脏的SOD活性变化趋势是先上升，在26℃处达到最高值，随后开始下降，直到29℃处降到最低值，而后又有小幅回升直到32℃。通过对各处理组中黑鲷SOD活性大小进行DUNCAN方差分析，差异性结果如表2中所示，26℃处的SOD活性明显受到诱導作用；0.5mg/L Cd2+溶液组试验96h后，黑鲷的肝脏中的SOD活性变化趋势是先略为上升,在26℃处达到最高值，随后开始下降，32℃处降到最低值。DUNCAN分析结果如表2所示，各组间差异不显著；温度与5.0 mg/L Cd2+处理96h后，黑鲷的肝脏中的SOD活性变化趋势是先上升，在26℃处达到最高值，随后开始下降到29℃，之后再回升。DUNCAN分析结果如表2所示，26℃处的SOD活性受到显著诱导作用。
由图2分析可知，空白海水试验96h后，黑鲷肝脏的CAT活性变化趋势是先上升后下降，在29℃处达到最高值，随后的32℃组的CAT活性迅速下降。由表2中的DUNCAN分析结果可知，29℃处CAT活性受到显著诱导；0.5mg/LCd2+溶液中试验96h后，黑鲷的肝脏中的CAT活性变化趋势是先上升,在26℃处达到最高值，随后开始下降，32℃处降到最低值。DUNCAN分析结果如表2所示，26℃处CAT活性明显受到诱导；5.0mg/L Cd2+溶液试验96h后，黑鲷的肝脏中的CAT活性变化趋势也是先上升，在26℃处达到最高值，随后开始下降直到32℃处降到最低。DUNCAN分析结果如表2所示，26℃处CAT的活性明显受到诱导作用。
3.讨论
3.1 抗氧化防御系统与Cd2+毒性机理
抗氧化防御系统是需氧生物体内重要的活性氧清除系统，主要包括酶性清除剂抗氧化酶，如SOD、CAT、GPx等，以及小分子抗氧化剂，如GSH、维生素c、维生素E等。在正常生理条件下，动物体内代谢产生的活性氧可被抗氧化防御系统有效清除。但当机体暴露于可产生氧化还原污染的污染物时，若活性氧的产生速度超出了机体抗氧化防御系统的清除能力，就会对机体造成氧化胁迫，从而引发一系列毒性效应，如脂质过氧化、DNA损伤、酶失活、甚至细胞死亡或癌变。早有研究报道，生物体内抗氧化成分会因污染胁迫的存在而改变[3]。
大量实验研究表明，动物的重金属中毒效应主要体现在自由基介导的氧化损伤。一方面，镉通过多种途径在体内诱发产生大量的自由基代谢物、活性氧。另一方面，镉也可以作用于细胞的抗氧化酶系统，降低细胞对氧自由基的清除能力。通过两方面的作用使体内产生大量氧自由基。而自由基及其反应产物往往可以通过夺氢、氧化巯基、破坏碳链等反应而使包括DNA在内的各种生物大分子结构和性质发生改变，进而导致各种病变，也可使不饱和脂肪酸过氧化，分解成丙二醛等物质，使生物大分子之间发生交联，聚合成异常的大分子，进而造成膜损伤，或降低膜的流动性，从而影响膜上或膜周围的对细胞增殖或凋亡有重要调节作用的酶。细胞内的CAT主要存在于过氧化物体内，在外源因子胁迫下细胞膜受到损伤，膜透性增加，从而导致CAT活性下降，与此同时，细胞内H202的水平保持稳定或增加。当外源因子胁迫程度较轻时，反而会使CAT活性增高，这可能是动物体内细胞防止活性氧伤害的一种保护反应。CAT是一种含Fe的金属酶，主要作用是催化H202分解成H20与O2- [3]。
3.2结果讨论
如图1中所示，各组黑鲷SOD活性变化规律性一般，但总体上看三条曲线，可以看出升温和Cd2+污染对黑鲷SOD活性变化有协同作用，复合处理后其活性水平明显比单一升温处理组要高，说明升温和Cd2+污染彼此加强了对黑鲷的SOD活性影响，毒理兴奋效应有所增强。
由图2可知，各组黑鲷CAT活性变化规律性比较强，三条曲线中黑鲷CAT活性都是随温度的升高先上升后下降的趋势，表明黑鲷在受到外界升温刺激后，体内活性氧自由基增多，从而诱导CAT等酶的水平升高，来消除自由基；在温度继续升高时，超过了黑鲷机体的自我调节能力，从而破坏了抗氧化还原系统，抑制了CAT的活性，导致其活性值下降。对比三条曲线可得各处理组CAT平均值大小为：0.5mg/L Cd2组>5.0 mg/L Cd2组>空白海水组，这是由于Cd2+污染与升温处理相互协同作用，使其毒性增强诱导CAT水平升高所致；而0.5mg/L Cd2处理组>5.0mg/L Cd2处理组，又说明相同条件下，低浓度复合处理比高浓度复合处理对CAT的诱导程度更大。
由圖1和2分析讨论的结果可得：升温与Cd2+污染复合处理对黑鲷肝脏SOD和CAT活性的毒性刺激，相比单一升温处理有所增强；SOD与CAT灵敏的反应出环境的变化情况，可用其作为氧化胁迫的生物生理指标，用来检测评估环境污染的状况。
参考文献
[1]徐立红，张甬元，陈宜瑜．分子生态毒理学研究进展及其在水环境保护中的意义[J].水生生物学报，1995，9(2)：171-185．
[2]Rainbow P S．海洋生物对重金属的积累及意义[J].海洋环境科学，1992，11(1)：44-51
[3]方允中，李文杰．自由基与酶基础理论及其在生物学和医学上的应用[M].北京，科学出版社，1989.
129-146
[4]郝志明，吴燕燕，李来好.罗非鱼内脏中酶的筛选[J].南方水产，2006，2(2)：38-42．
[5]李永祺，丁美丽。海洋污染生物学[M].北京：海洋出版社，1991，277－305．
[6]周永欣，章宗涉．水生生物毒性试验方法论[M].北京：农业出版社．1989．
[7]王晓伟，李纯厚，沈南南.石油污染对海洋生物的影响[J].南方水产，2006，2(2)：76-80．
基金项目：农业部海洋与河口渔业重点开放实验室开放基金资助（开－1－04－05）。
作者简介：谢汉阳，男，浙江象山人，在职研究生，主要从事渔业水域环境评价与保护研究。