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摘 要：本实验建立了测定黑曲霉（Aspergillus niger）发酵液中5-HMF含量的紫外分光光度法。对5-HMF标准溶液进行全波长扫描，确定最大吸收波长为测定波长，并绘制5-HMF浓度与吸光度之间的标准曲线;用50%乙醇将原发酵液稀释50倍，在测定波长处测定吸光度，对应标准曲线，计算发酵液中的5-HMF含量。结果表明，5-HMF最大吸收波长为283 nm，R2为0.9995，线性关系良好，发酵液5-HMF平均浓度为171.743 μg/mL，平均回收率105.86%，精密度RSD为0.13%，重复性RSD为0.40%，仪器检出限为0.007 μg/mL。该方法简便，快速，成本低，准确度较高，为今后研究黑曲霉中5-HMF含量提供了一个可借鉴的方法。
关键词：黑曲霉;5-HMF;紫外分光光度法
中图分类号：Q939.96
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2018）06-0087-05 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.015
5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF），又名5-羟甲基-2-糠醛[1]，由葡萄糖或果糖脱水生成[2]，其分子中含有一个呋喃环，醛基和羟基，性质非常活泼，可通过氧化、氢化和缩合等反应制备多种衍生物，是一种良好的化学平台物质。5-羟甲基糠醛可用于生产燃料和反应中间体[3]，同时还有抗癌细胞增值活性，降血糖等药理作用[4-5]，近年我国5-羟甲基糠醛产品行业销售收入呈指数增长[6]，应用前景广泛。
黑曲霉为曲霉属的一个常见种[7]，可生产柠檬酸[8]，糖化酶[9]等，也可作为宿主进行外源表达，广泛用于食品原料、药物、酶的生产[10-11]，是发酵工业中的重要菌种。于能江[12]从头孢酶属的发酵物中分离出5-HMF，陈楠等人[13]从蜜环菌中提取5-HMF，均表明微生物发酵液中可产5-HMF。黑曲霉在工业生产中应用广泛，利用黑曲霉发酵生产5-HMF可弥补化学法步骤复杂繁琐的缺点。在对黑曲霉中5-HMF高产培养体系的建立中对发酵液内的5-HMF含量测定是必不可少的步骤。
目前测定5-HMF的方法主要有HPLC法[14-16]、紫外分光光度法[17-19]、衍生化分光光度法[20]等。HPLC法样本处理及测定过程繁琐复杂且成本较高，不适用于长期而频繁的测定;衍生化分光光度法需将5-HMF生成衍生化合物后间接测量，步骤较繁琐，紫外分光光度法简单快捷，在5-HMF的测定中应用较多。如冯红伟等人[21]利用紫外分光光度法测定糖蜜中的5-HMF，刘月新[22]利用紫外分光光度法测定四物汤传统汤剂中的5-HMF。本实验将利用紫外分光光度法对黑曲霉发酵液中5-HMF含量进行测定。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 菌种
黑曲霉（Aspergillus niger）xj：中国典型培养物保藏中心保存，CCTCC No：M206021。
1.1.2 试剂
5-HMF（≥99.0%）：广东翁江化学试剂有限公司;无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司;葡萄糖（分析纯）：天津市优谱化学试剂有限公司。
1.1.3 仪器与设备
BIOMATE 3S紫外分光光度計：赛默飞世尔科技有限公司;UV-8000紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司;华普达THZ-82恒温振荡器：常州华普达有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 5-HMF标准品全波长扫描与标准曲线绘制
精确吸取2.5 μL 5-HMF标准品，利用50%乙醇配制成31.075 μg/mL的储备液。精确吸取10 mL母液，加入40 mL 50%乙醇，配制浓度为6.215 μg/mL的标准液。
将标准液于UV-8000紫外可见分光光度计进行全波长扫描，取最大吸收峰值对应波长作为测定波长。
将标准液用50%乙醇梯度稀释，得0、1.243 μg/mL、2.486 μg/mL、3.729 μg/mL、4.972 μg/mL、6.215 μg/mL的6份稀释液。6份样品以50%乙醇为参比，在测定波长进行吸光度测定，并绘制标准曲线。
1.2.2 黑曲霉发酵液中5-HMF浓度的测定
将黑曲霉接种至PDB培养基，于26℃，150 r/min振荡频率下培养5 d，过滤掉发酵液中的菌丝球及孢子，于发酵液中加入等体积的无水乙醇，10000 r/min离心10 min沉淀絮状变性蛋白，吸取上清液，继续加入50%乙醇，得到原发酵液50倍稀释度的稀释液。
分别取稀释液2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL加入5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL的50%乙醇，得到5个梯度稀释样品，以50%乙醇为参比，于283 nm下测定吸光度，根据标准曲线计算发酵液中的5-HMF平均浓度。
1.2.3 精密度测定
取同一份稀释液8份，以同样方法直接测定吸光度，计算相对标准偏差。
1.2.4 回收率测定
配置与发酵液5-HMF浓度相近的5-HMF标准溶液，与发酵液在相同稀释度下等体积混合后测定，计算回收率。
1.2.5 重复性实验
对同一批发酵液以相同方法平行处理，分析重复性。
1.2.6 仪器检出限测定
配制浓度为0.213 μg/mL、0.426 μg/mL、0.533 μg/mL、0.639 μg/mL的5-HMF标准溶液，利用BIOMATE 3S紫外分光光度计测定吸光度，绘制低浓度下的标准曲线，并测定20组参比的吸光度，计算仪器检出限。 2 结果与分析
2.1 全波长扫描
标准液于190～1100 nm进行全波长扫描，发现283 nm处有最大吸收峰（200～400 nm部分扫描结果），故采用283 nm作测定波长。
2.2 5-HMF标准品浓度与吸光度回归曲线
5-HMF标准品溶解于50%乙醇中，其通过计算得到的浓度与所对应的吸光度结果见表1，线性回归曲线，R2为0.9995，线性关系良好，回归方程为y = 0.1225x + 0.005。
2.3 发酵液5-HMF浓度测定
对稀释液梯度稀释后的6份样品测定，利用标准曲线求出浓度（见表2），再分别根据总稀释度求出原发酵液5-HMF浓度，为165.714 μg/mL、173.333 μg/mL、172.143 μg/mL、173.714 μg/mL、173.810 μg/mL，平均值为171.743 μg/mL。
2.4 精密度测定
取稀释液8份，直接进行紫外分光测定（见表3），RSD为0.13%，重现性良好。
2.5 回收率测定
配制186.450 μg/mL的5-HMF标准溶液，与原发酵液各稀释50倍后等体积混合并测定（结果见表4），平均回收率为105.86%，RSD为1.03%，回收率较好，可以较准确反映发酵液中5-HMF实际含量。
2.6 重复性实验
取同一批发酵液8份，以同样方法测定其中5-HMF含量（见表5），RSD为0.40%，重复性良好。
2.7 仪器检出限
配制0.746 μg/mL的低浓度5-HMF标准溶液，进行梯度稀释，绘制标准曲线，计算其斜率，低浓度时灵敏度0.1397。以20组50%乙醇进行空白测定，得空白均值为0.009，空白值标准偏差为0.03%，根据IUPAC标准[23]，k取3用于检出限计算，得最小分析信号为0.010，BIOMATE 3S紫外分光光度计测定黑曲霉发酵液中5-HMF浓度检出限为0.007 μg/mL。
3 结论与讨论
本實验建立了测定黑曲霉发酵液中5-HMF含量的紫外分光光度法。5-HMF标准品全波长扫描得283 nm处有最大吸收峰，故以283 nm作为测定波长;标准曲线为y=0.1225x+0.005，线性关系良好，用此法测定黑曲霉xj发酵液中的5-HMF平均浓度为171.743 μg/mL，与HPLC测定结果0.1257 mg/g相近[24]，平均回收率为105.86%，能较准确地反应5-HMF实际含量，方法重现性良好。仪器检出限为0.007 μg/mL，可以精准测定。此法操作简便快速，成本低，准确度较高，但由于比色法会受到一定的干扰，测定结果不能视为5-HMF绝对含量，可为研究黑曲霉中5-HMF含量提供一个可借鉴的方法。
参 考 文 献：
[1] 王 军，张春鹏，欧阳平凯.5-羟甲基糠醛制备及应用的研究进展[J].化工进展，2008，27（5）：702-707.
[2] 姜 楠，齐 崴，黄仁亮，等.生物质制备5-羟甲基糠醛的研究进展[J].化工进展，2011，30（9）：1937-1945.
[3] Román-Leshkov Y，Dumesic J A.Solvent Effects on Fructose Dehydration to 5-Hydroxymethylfurfural in Biphasic Systems Saturated with Inorganic Salts[J].Topics in Catalysis，2009，52（3）：297-303.
[4] 赵 玲，陈建平，李 琳，等.5-羟甲基糠醛抗氧化性及其抗细胞增殖活性的研究[J].现代食品科技，2013，29（11）：2638-2642.
[5] 曲欣楠，郑毅男，刘文丛，等.中药活性小分子5-羟甲基糠醛生物活性研究进展[J].特产研究，2014，36（1）：72-76.
[6] 中国5-羟甲基糠醛市场发展研究报告[R].中国市场调查研究中心，2012.
[7] 邢来君，李明春，魏东盛.普通真菌学[M].北京：高等教育出版社，2010：391.
[8] 秦含章.黑曲霉菌种与柠檬酸工业[J].酿酒，1980（1）：12-15.
[9] 鲁洪中.基于～（13）C代谢流和基因组规模代谢网络模型的黑曲霉产糖化酶代谢调控机理研究[D].上海：华东理工大学，2016.
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[11] MEYER V，BO W，RAM A F J.Aspergillus，as a multi-purpose cell factory：current status and perspectives[J].Biotechnology Letters，2011，33（3）：469.
[12] 于能江.两种真菌的次生代谢产物和生物活性研究[D].北京：中国协和医科大学，2002.
[13] 陈 楠，焦连庆，郑毅男，等.蜜环菌发酵液中5-羟甲基糠醛提取工艺优化[J].特产研究，2012，34（1）：31-33. [14] LIU X，AI N，ZHANG H，et al. Quantification of glucose，xylose，arabinose，furfural，and HMF in corncob hydrolysate by HPLC-PDA-ELSD[J].Carbohydrate Research，2012，353（9）：111-114.
[15] 周志营，陈 霞，徐 凯，等.HPLC法测定麦芽中的5-羟甲基糠醛[J].食品工业，2015，36（8）：270-273.
[16] 王 宇，张玉兰.HPLC法测定党参中5-羟甲基糠醛的含量[J].西部中医药，2014，27（2）：31-33.
[17] 连 会，彭奇均.紫外分光光度法测定蜂蜜中四环素和羟甲基糠醛[J].理化检验（化学分册），2008，44（6）：570-571.
[18] 蘇孝礼，朱运良，陈 华，等.紫外分光光度法测定蜜丸中5-羟甲基糠醛的含量[J].中成药，1994（2）：12-13，58.
[19] 梁俪恩.紫外分光光度法测定腹膜透析液中的降解产物5-羟甲基糠醛[J].广东药学院学报，2003，19（2）：133-133.
[20] TU D，XUE S，MENG C.Simultanous determination of 2-FUR and 5-HMF by deriva- tivespectrophotometry[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40（6）：1022-1025.
[21] 冯红伟，扶 雄.紫外分光光度法测定糖蜜中5-羟甲基糠醛含量[J].食品工业科技，2010，31（3）：365-367.
[22] 刘月新.四物汤传统汤剂中5-羟甲基糠醛的含量测定[J].中国现代药物应用，2013，7（17）：1-2.
[23] 高若梅，刘鸿皋.检出限概念问题讨论——IUPAC及其它检出限定义的综合探讨和实验论证[J].分析化学，1993（10）：1232-1236.
[24] 张 素，吉玉玉，肖 洋，等.HPLC法检测黑曲霉发酵液中5-羟甲基糠醛的研究[J].中国酿造，2018，37（3）：154-156.
关键词：黑曲霉;5-HMF;紫外分光光度法
中图分类号：Q939.96
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2018）06-0087-05 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.015
5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF），又名5-羟甲基-2-糠醛[1]，由葡萄糖或果糖脱水生成[2]，其分子中含有一个呋喃环，醛基和羟基，性质非常活泼，可通过氧化、氢化和缩合等反应制备多种衍生物，是一种良好的化学平台物质。5-羟甲基糠醛可用于生产燃料和反应中间体[3]，同时还有抗癌细胞增值活性，降血糖等药理作用[4-5]，近年我国5-羟甲基糠醛产品行业销售收入呈指数增长[6]，应用前景广泛。
黑曲霉为曲霉属的一个常见种[7]，可生产柠檬酸[8]，糖化酶[9]等，也可作为宿主进行外源表达，广泛用于食品原料、药物、酶的生产[10-11]，是发酵工业中的重要菌种。于能江[12]从头孢酶属的发酵物中分离出5-HMF，陈楠等人[13]从蜜环菌中提取5-HMF，均表明微生物发酵液中可产5-HMF。黑曲霉在工业生产中应用广泛，利用黑曲霉发酵生产5-HMF可弥补化学法步骤复杂繁琐的缺点。在对黑曲霉中5-HMF高产培养体系的建立中对发酵液内的5-HMF含量测定是必不可少的步骤。
目前测定5-HMF的方法主要有HPLC法[14-16]、紫外分光光度法[17-19]、衍生化分光光度法[20]等。HPLC法样本处理及测定过程繁琐复杂且成本较高，不适用于长期而频繁的测定;衍生化分光光度法需将5-HMF生成衍生化合物后间接测量，步骤较繁琐，紫外分光光度法简单快捷，在5-HMF的测定中应用较多。如冯红伟等人[21]利用紫外分光光度法测定糖蜜中的5-HMF，刘月新[22]利用紫外分光光度法测定四物汤传统汤剂中的5-HMF。本实验将利用紫外分光光度法对黑曲霉发酵液中5-HMF含量进行测定。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 菌种
黑曲霉（Aspergillus niger）xj：中国典型培养物保藏中心保存，CCTCC No：M206021。
1.1.2 试剂
5-HMF（≥99.0%）：广东翁江化学试剂有限公司;无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司;葡萄糖（分析纯）：天津市优谱化学试剂有限公司。
1.1.3 仪器与设备
BIOMATE 3S紫外分光光度計：赛默飞世尔科技有限公司;UV-8000紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司;华普达THZ-82恒温振荡器：常州华普达有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 5-HMF标准品全波长扫描与标准曲线绘制
精确吸取2.5 μL 5-HMF标准品，利用50%乙醇配制成31.075 μg/mL的储备液。精确吸取10 mL母液，加入40 mL 50%乙醇，配制浓度为6.215 μg/mL的标准液。
将标准液于UV-8000紫外可见分光光度计进行全波长扫描，取最大吸收峰值对应波长作为测定波长。
将标准液用50%乙醇梯度稀释，得0、1.243 μg/mL、2.486 μg/mL、3.729 μg/mL、4.972 μg/mL、6.215 μg/mL的6份稀释液。6份样品以50%乙醇为参比，在测定波长进行吸光度测定，并绘制标准曲线。
1.2.2 黑曲霉发酵液中5-HMF浓度的测定
将黑曲霉接种至PDB培养基，于26℃，150 r/min振荡频率下培养5 d，过滤掉发酵液中的菌丝球及孢子，于发酵液中加入等体积的无水乙醇，10000 r/min离心10 min沉淀絮状变性蛋白，吸取上清液，继续加入50%乙醇，得到原发酵液50倍稀释度的稀释液。
分别取稀释液2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL加入5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL的50%乙醇，得到5个梯度稀释样品，以50%乙醇为参比，于283 nm下测定吸光度，根据标准曲线计算发酵液中的5-HMF平均浓度。
1.2.3 精密度测定
取同一份稀释液8份，以同样方法直接测定吸光度，计算相对标准偏差。
1.2.4 回收率测定
配置与发酵液5-HMF浓度相近的5-HMF标准溶液，与发酵液在相同稀释度下等体积混合后测定，计算回收率。
1.2.5 重复性实验
对同一批发酵液以相同方法平行处理，分析重复性。
1.2.6 仪器检出限测定
配制浓度为0.213 μg/mL、0.426 μg/mL、0.533 μg/mL、0.639 μg/mL的5-HMF标准溶液，利用BIOMATE 3S紫外分光光度计测定吸光度，绘制低浓度下的标准曲线，并测定20组参比的吸光度，计算仪器检出限。 2 结果与分析
2.1 全波长扫描
标准液于190～1100 nm进行全波长扫描，发现283 nm处有最大吸收峰（200～400 nm部分扫描结果），故采用283 nm作测定波长。
2.2 5-HMF标准品浓度与吸光度回归曲线
5-HMF标准品溶解于50%乙醇中，其通过计算得到的浓度与所对应的吸光度结果见表1，线性回归曲线，R2为0.9995，线性关系良好，回归方程为y = 0.1225x + 0.005。
2.3 发酵液5-HMF浓度测定
对稀释液梯度稀释后的6份样品测定，利用标准曲线求出浓度（见表2），再分别根据总稀释度求出原发酵液5-HMF浓度，为165.714 μg/mL、173.333 μg/mL、172.143 μg/mL、173.714 μg/mL、173.810 μg/mL，平均值为171.743 μg/mL。
2.4 精密度测定
取稀释液8份，直接进行紫外分光测定（见表3），RSD为0.13%，重现性良好。
2.5 回收率测定
配制186.450 μg/mL的5-HMF标准溶液，与原发酵液各稀释50倍后等体积混合并测定（结果见表4），平均回收率为105.86%，RSD为1.03%，回收率较好，可以较准确反映发酵液中5-HMF实际含量。
2.6 重复性实验
取同一批发酵液8份，以同样方法测定其中5-HMF含量（见表5），RSD为0.40%，重复性良好。
2.7 仪器检出限
配制0.746 μg/mL的低浓度5-HMF标准溶液，进行梯度稀释，绘制标准曲线，计算其斜率，低浓度时灵敏度0.1397。以20组50%乙醇进行空白测定，得空白均值为0.009，空白值标准偏差为0.03%，根据IUPAC标准[23]，k取3用于检出限计算，得最小分析信号为0.010，BIOMATE 3S紫外分光光度计测定黑曲霉发酵液中5-HMF浓度检出限为0.007 μg/mL。
3 结论与讨论
本實验建立了测定黑曲霉发酵液中5-HMF含量的紫外分光光度法。5-HMF标准品全波长扫描得283 nm处有最大吸收峰，故以283 nm作为测定波长;标准曲线为y=0.1225x+0.005，线性关系良好，用此法测定黑曲霉xj发酵液中的5-HMF平均浓度为171.743 μg/mL，与HPLC测定结果0.1257 mg/g相近[24]，平均回收率为105.86%，能较准确地反应5-HMF实际含量，方法重现性良好。仪器检出限为0.007 μg/mL，可以精准测定。此法操作简便快速，成本低，准确度较高，但由于比色法会受到一定的干扰，测定结果不能视为5-HMF绝对含量，可为研究黑曲霉中5-HMF含量提供一个可借鉴的方法。
参 考 文 献：
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[3] Román-Leshkov Y，Dumesic J A.Solvent Effects on Fructose Dehydration to 5-Hydroxymethylfurfural in Biphasic Systems Saturated with Inorganic Salts[J].Topics in Catalysis，2009，52（3）：297-303.
[4] 赵 玲，陈建平，李 琳，等.5-羟甲基糠醛抗氧化性及其抗细胞增殖活性的研究[J].现代食品科技，2013，29（11）：2638-2642.
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[6] 中国5-羟甲基糠醛市场发展研究报告[R].中国市场调查研究中心，2012.
[7] 邢来君，李明春，魏东盛.普通真菌学[M].北京：高等教育出版社，2010：391.
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[11] MEYER V，BO W，RAM A F J.Aspergillus，as a multi-purpose cell factory：current status and perspectives[J].Biotechnology Letters，2011，33（3）：469.
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[15] 周志营，陈 霞，徐 凯，等.HPLC法测定麦芽中的5-羟甲基糠醛[J].食品工业，2015，36（8）：270-273.
[16] 王 宇，张玉兰.HPLC法测定党参中5-羟甲基糠醛的含量[J].西部中医药，2014，27（2）：31-33.
[17] 连 会，彭奇均.紫外分光光度法测定蜂蜜中四环素和羟甲基糠醛[J].理化检验（化学分册），2008，44（6）：570-571.
[18] 蘇孝礼，朱运良，陈 华，等.紫外分光光度法测定蜜丸中5-羟甲基糠醛的含量[J].中成药，1994（2）：12-13，58.
[19] 梁俪恩.紫外分光光度法测定腹膜透析液中的降解产物5-羟甲基糠醛[J].广东药学院学报，2003，19（2）：133-133.
[20] TU D，XUE S，MENG C.Simultanous determination of 2-FUR and 5-HMF by deriva- tivespectrophotometry[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40（6）：1022-1025.
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[22] 刘月新.四物汤传统汤剂中5-羟甲基糠醛的含量测定[J].中国现代药物应用，2013，7（17）：1-2.
[23] 高若梅，刘鸿皋.检出限概念问题讨论——IUPAC及其它检出限定义的综合探讨和实验论证[J].分析化学，1993（10）：1232-1236.
[24] 张 素，吉玉玉，肖 洋，等.HPLC法检测黑曲霉发酵液中5-羟甲基糠醛的研究[J].中国酿造，2018，37（3）：154-156.