caveolin—1脚手架样结构域多肽对HEp2细胞迁移和侵袭能力的影响

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  [摘要] 目的 研究caveolin-1脚手架样结构域(caveolin-scaffolding domain,CSD)多肽对HEp2细胞迁移和侵袭能力的影响,并探讨其分子机制。 方法 CSD多肽和乱序多肽由人工合成得到,并在N’末端用生物素标记。用免疫细胞化学法检测CSD多肽在HEp2细胞中的渗透情况,划痕实验检测细胞的迁移能力,Transwell细胞体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力;免疫印迹法检测HEp2细胞中FAK蛋白的表达水平及磷酸化程度。 结果 免疫细胞化学检测显示CSD多肽能够较好地进入HEp2细胞内;CSD多肽组HEp2细胞迁移能力明显低于乱序组和空白对照组(P均<0.01),而乱序肽组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);CSD多肽组发生侵袭的细胞数明显低于乱序组和空白对照组(P均<0.01),而乱序肽组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);免疫印迹法检测结果显示,CSD多肽组FAK相对磷酸化程度明显低于乱序组与空白对照组(P均<0.01)。 结论 caveolin-1脚手架样结构域多肽可顺利进入HEp2细胞内,而且可以抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,FAK磷酸化水平的下调可能是其中重要的分子机制。
  [关键词] Caveolin-1;粘着斑激酶;多肽;鳞状细胞癌;肿瘤浸润
  [中图分类号] R73-3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2016)30-0029-04
  Caveolin-1是人体细胞膜上重要的膜蛋白,它能够和许多信号转导相关蛋白结合,影响下游信号通路活性,从而调节细胞的生物学行为。在部分肿瘤的研究中,Caveolin-1基因的过表达可以抑制肿瘤细胞的生长。Caveolin-1蛋白结构中存在一个脚手架样的区域(caveolin-scaffolding domain, CSD),CSD是caveolin-1参与调节细胞膜蛋白生物学活性的重要区域,在细胞生命活动中发挥重要作用[1]。肽类药物因其具有特异性的靶向作用,正逐渐成为肿瘤治疗研究的热点[2]。本研究通过人工合成CSD多肽,观察其作用于喉鳞状细胞癌HEp2细胞株后,对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的影响,并初步探讨其机制。
  1 材料与方法
  1.1细胞及培养条件
  人喉鳞状细胞癌HEp2细胞株购于美国ATCC公司,用含10%胎牛血清(hyclone公司,美国)的DMEM培养基培养,培养条件:37℃、5%CO2、饱和湿度。
  1.2 CSD多肽的氨基酸序列与合成
  CSD多肽氨基酸序列为DGI WKA SFT TFT VTK YWF YR,以同样的氨基酸种类和数量随机排列,并合成得到的乱序多肽做为阴性对照。多肽序列均由上海翱博生物科技有限公司合成,肽链N端连接生物素标记,多肽作用于细胞的终浓度为4.0 μM。
  1.3 免疫细胞化学法检测多肽的细胞渗透效能
  HEp2细胞贴壁生长至细胞密度为70%时,加入CSD多肽孵育6 h后,弃去培养液,加入冷丙酮固定10’,然后滴加碱性磷酸酶(AP)标记的抗生物素抗体(工作浓度1:300;Jackson Immuno Research公司,美国),在湿盒内37 ℃孵育2 h,用PBS冲洗后加入5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝(NBT/BCIP;Roche公司,瑞士)显色。
  1.4 细胞划痕实验
  取2×105 HEp2细胞接种于六孔培养板中,当细胞生长至100%汇合时,换无血清培养液,实验组中加入CSD多肽,乱序多肽做为阴性对照组,无血清培养液为空白对照组。用移液器管嘴在细胞层轻轻划出约1 mm宽的划痕后继续培养,在0、24 h、48 h时镜下用Zeiss LSM Image Browser 3.1 软件(Mississauge公司,加拿大)测量划痕的宽度变化,细胞迁移率=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验均重复3次。
  1.5 Transwell细胞体外侵袭实验
  实验使用Biocoat Matrigel Invasion Chamber试剂盒(BD公司,美国),根据试剂盒说明书操作,步骤简述如下:获得约5×103 HEp2细胞,接种于上层小室中,加入无血清培养液至300 mL,实验组中加入CSD多肽,乱序多肽做为阴性对照组,无血清培养液为空白对照组,37 ℃培养24 h后,用棉签把表层的细胞抹去,加入4%多聚甲醛固定30 min,800 μL Giemsa染液染色20 min,取出膜片至顯微镜下观察,随机选取10个400倍视野计数细胞。实验均重复3次。
  1.6 免疫印迹法
  细胞分为三组,实验组中加入CSD多肽,乱序多肽做为阴性对照组,无血清培养液为空白对照组,细胞培养24 h后,HEp2细胞用含有磷酸化酶抑制剂的蛋白裂解液处理,得到细胞总蛋白,蛋白用BCA法测定浓度,取60 μg蛋白行SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上,用5%的脱脂奶粉封闭后加入一抗,4℃孵育过夜,PBS冲洗后加入HRP标记的二抗(工作浓度1:2000,Santa Cruz公司,美国),目的蛋白条带的显示使用ECL试剂盒(pierce公司,美国),按照说明书步骤操作曝光显影,目的条带用Pro analyzer 4.0软件进行分析。一抗:小鼠抗人Phospho-FAK(Tyr397)及FAK单克隆抗体(Bioscience公司,美国),工作浓度1∶1000;小鼠抗人β-actin单克隆抗体(Sigma公司,美国),工作浓度1∶1000。实验均重复3次。
  1.7 统计学方法
  采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK法,P<0.05为差异有统计学意义。   2 结果
  2.1 CSD多肽能够渗透进入HEp2细胞内
  免疫细胞学检测结果显示,在CSD多肽处理的HEp2细胞中,经NBT/BCIP显色,显微镜下可看到HEp2细胞胞质中显现出蓝紫色颗粒(图1),说明CSD多肽能够透过细胞膜有效渗入到细胞内部。
  2.2 CSD多肽对HEp2细胞迁移能力的影响
  细胞划痕实验结果显示,CSD多肽组、乱序肽组和空白对照组的48 h细胞迁移率分别为(15.11±3.09)%、(66.45±5.24)%和(68.13±5.73)%,三组差异有统计学意义(F=116.77,P<0.01);CSD多肽组细胞迁移能力明显低于乱序肽组和空白对照组(P均<0.01),而乱序肽组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。
  2.3 CSD多肽对HEp2细胞侵袭能力的影响
  细胞体外侵袭能力检测结果显示,CSD多肽组、乱序肽组及空白对照组每高倍视野侵袭的细胞数分别为(131.38±43.42)、(373.51±56.24)和(384.39±53.68),三组差异有统计学意义(F=23.14,P<0.01);CSD多肽组细胞侵袭能力明显低于乱序肽组和空白对照组(P均<0.01),而乱序肽组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。
  2.4 CSD多肽对HEp2细胞FAK磷酸化的影响
  免疫印迹法检测结果显示,CSD多肽组、乱序肽组与空白对照组的FAK相对磷酸化程度(磷酸化FAK蛋白量/总FAK蛋白量)分别为(0.23±0.02)、(0.43±0.04)、(0.45±0.03),三组比较差异有统计学意义(F=44.20,P<0.01),CSD多肽组明显低于空白对照组与乱序肽组(P均<0.01),乱序肽组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。CSD多肽组、乱序肽组、空白对照组的总FAK蛋白表达量组间比较差异无统计学意义(F=0.052,P>0.05)。见图4。
  3 讨论
  人体细胞的细胞膜上存在一个小凹样结构,称为caveolea,caveolea在细胞生命活动中非常重要。Caveolin-1是caveolae的主要功能蛋白,大小为21~24 kD,caveolin-1蛋白由178个氨基酸构成,其N端第82~101氨基酸残基是其重要功能区域,具有一个脚手架样结构(caveolin-scaffolding domain,CSD),这个CSD结构可以和许多信号转导相关蛋白结合,并调节其下游信号转导通路的活性,最终影响细胞的生物学行为[1]。
  研究发现许多肿瘤细胞株的caveolin-1表达处于低水平状态,增加caveolin-1的表达可以抑制肿瘤细胞的生长和转移、促进肿瘤的凋亡[3,4]。一些肿瘤的临床病理学研究发现,在乳腺癌[5]、肝细胞性肝癌[6]、结肠腺癌[7]的癌细胞中caveolin-1的表达水平越低,肿瘤患者的预后越差。因此许多学者认为caveolin-1基因可能是一个抑癌基因。但是,有其他一些研究却得出了相反的结果,发现caveolin-1的高表达与肿瘤的恶性生物学行为相关[8], 例如, 在肺大细胞癌中,caveolin-1表达越高,病人的预后越差[9],增加caveolin-1基因的表达可以促进子宫内膜癌[10]和胰腺癌细胞株[11]生长和转移能力。因此,caveolin-1很可能在不同的条件下发挥不同的生物学功能。
  Ortiz等[12]在黑色素瘤的研究中发现caveolin-1蛋白第14位酪氨酸残基的磷酸化能够增强肿瘤细胞的侵袭转移能力,而不能发生磷酸化的突变caveolin-1基因(Y14F-CAV1基因)却不具有这样的促进功能。许多研究表明前列腺癌中caveolin-1基因处于高表达的状态,而且caveolin-1的高表达与肿瘤的恶性程度正相关[13,14],而用caveolin-1脚手架结构域氨基酸序列人工合成多肽(CSD肽),并且用CSD多肽作用于前列腺癌细胞,却能够抑制肿瘤细胞的生长,并且减少肿瘤组织内新生血管的生成[15]。因此,有理由推测,caveolin-1蛋白的CSD区域是其发挥抑制肿瘤效应的关键部位,当其N端氨基酸残基磷酸化后,caveolin-1蛋白可能由于分子构象的改变而使CSD的功能受到了抑制。如果能够使CSD结构处于持续的活性状态,很可能就可以充分发挥CAV1的抗肿瘤的功能。
  喉鳞状细胞癌是头颈部肿瘤中的常见类型,研究表明,caveolin-1基因的过表达可以抑制喉鳞癌细胞株HEp2细胞的生长能力[16],而且低表达caveolin-1基因的头颈部鳞癌更容易发生上皮-间质转化和淋巴结转移[17],表明caveolin-1在喉鳞癌中可能具有抑制肿瘤的作用。本研究中,我们人工体外合成得到了CSD多肽,并且作用于HEp2细胞,实验结果显示CSD多肽能够顺利进入HEp2细胞内,说明CSD多肽具有较好的渗透性。用CSD多肽处理HEp2细胞后,肿瘤细胞的细胞迁移能力下降了77.82%,侵袭能力下降了65.82%,均被明显抑制,而乱序肽并无明显抑制效果,表明用外源性的CSD多肽在体外能够抑制HEp2细胞的侵袭转移能力,具有一定的潜在临床应用前景。
  CSD多肽能够与细胞内的许多生物活性蛋白结合,并影响相关的信号通路活性。肿瘤细胞的侵袭和转移是一个多因素参与的复杂过程,许多信号转导通路在其中发挥重要的作用。粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是蛋白酪氨酸激酶超家族中的一员,很多肿瘤中FAK的表达升高,目前的研究表明其表达与肿瘤的转移情况密切相关,FAK能够发生磷酸化并被激活,從而通过激活相关的信号通路促进肿瘤细胞的侵袭和转移能力[18,19]。因此,我们检测了HEp2细胞中FAK磷酸化水平,发现用CSD多肽处理HEp2细胞后,FAK相对磷酸化水平下降了48.89%。在一项黑色素瘤的研究中,研究者发现caveolin-1能够通过下调黑色素瘤B16F10 细胞株FAK的磷酸化水平, 抑制肿瘤细胞的转移能力[20]。FAK磷酸化水平的下降可能是CSD多肽抑制HEp2细胞侵袭转移能力的重要机制,但CSD多肽通过何种分子机制影响FAK的磷酸化水平还需要深入研究。   綜上所述,本研究体外细胞学实验结果提示CSD多肽能够顺利进入HEp2细胞内,并能够抑制HEp2细胞的迁移和侵袭能力,FAK磷酸化水平的下调可能是其中重要的分子机制,CSD多肽的抑制肿瘤的功能及具体的分子机制还有待进一步探讨。
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  (收稿日期:2016-08-05)
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