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摘 要：对泉州市某区海产品中的霍乱弧菌进行实时荧光定量PCR检测，经特异性试验表明：该方法能选择性检测O1和O139群霍乱弧菌，而且特异性好、灵敏度高，能有效克服假阳性，结合传统的病原微生物培养方法，可用于临床检验及卫生检测。检测结果显示，该次送检海产品检出的2例O1霍乱弧菌均无毒力基因ctx，但仍需加强监测，预防散发和暴发流行。
关键词：霍乱弧菌；荧光定量PCR；检测
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2017.06.005
Real-time fluorescence quantitative PCR detection and analysis ofVibrio cholerae in some marine products in Quanzhou City
ZHUNAG Yue-e
（Quanzhou Medical Technical College， Fujian Province 362000）
Abstract： Vibrio cholerae in some marine products in Quanzhou City was detected by real-time fluorescent quantitative PCR， the specificity test showed that this method could selectively detect Vibrio cholerae O1 and O139 group with good specificity and high sensitivity， and effectively overcome the false positives， and had great guidance on the significance of clinical examination and health inspection combined with the traditional culture method of pathogenic microorganisms. The tested results showed that both two case of detected Vibrio cholerae from tested marine products had no virulence genes CTX， but still needed to strengthen the monitoring to prevent distribution and outbreak of the disease.
Key words： Vibrio cholerae； fluorescent quantitative PCR； detection
霍乱是因霍乱弧菌污染而引起的一种急性腹泻性传染病，主要临床表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水、死亡率高[ 1]，其中，O1和O139两种霍乱弧菌的血清型能够引起疾病暴发，其主要传播途径是通过水源或饮食经口传染。随着荧光定量PCR技术的广泛应用，许多由食源性病菌或者病毒引发的急性中毒都可以在很短的时间内检测出来，具有灵敏、准确、快速、污染少等优点。因此，运用荧光定量PCR等技术建立针对霍乱病菌污染防治的突发群体性公共卫生事件应急体系，以及开展霍乱的流行病学和病原学研究具有重要的科学意义。
1 材料与方法
1.1 检测样本
由泉州市某沿海区疾控中心提供的咸水及淡水鱼类、虾类及贝壳类等水产品样本60份。
1.2 主要仪器与试剂
主要仪器为ABI 7500型定量PCR仪，O1 群和O139群霍乱弧菌诊断血清试剂，庆大琼脂、TCBS等培养基，QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA 提取试剂盒。
1.3 试验方法
1.3.1 增菌 在碱性蛋白胨水中，37℃增菌6～8 h。
1.3.2 核酸提取 取增菌后的待测样品1.0～1.5 mL至无菌离心管，8000 r/min离心4 min，除去上清液，加入DNA提取液50 μL ，振荡混匀后沸水浴5 min，13000 r/min离心5 min；上清液于-20℃保存备用。
1.3.3 检测
（1）将PCR反应液放置至实验室室温平衡，融化后取Taq酶，测试反应体系配制为：PCR反应液22.5 μL+Taq酶0.4 μL 。
（2）加入模板：將事先保存在-20℃的样品核酸提取物解冻，以13000 r/min离心5 min。在每个PCR反应体系中分别加入模板、阴性对照、阳性对照各2 μL，记录相应样品号。
（3）上机扩增、检测区：反应条件为95℃、3 min，1个循环；95℃、5 s，60℃、40 s（信号采集），40个循环。反应体系设为25 μL。对于多通道荧光PCR仪，信号采集时设定为Fam荧光素。
1.4 霍乱弧菌的传统培养方法
霍乱弧菌的分离培养及生化鉴定参照《霍乱诊断标准》（WS289-2008）和《霍乱防治手册》（第五版）。挑取较大、透明、扁平、湿润且边缘整齐的菌落， 分别与多价血清、O139诊断血清等诊断血清进行凝集试验，同时以生理盐水作为阴性对照。
2 结果与分析
2.1 分子检测结果
2.1.1 特异性检测 对霍乱弧菌以及其他7个食源性病菌分别用实时荧光定量PCR方法进行检测。结果显示，霍乱弧菌检测结果呈阳性，其他细菌检测结果均呈阴性。说明该方法不会与其他食源性病菌的检测发生交叉反应，对霍乱弧菌的检测有良好的特异性。 2.1.2 检测结果 霍乱弧菌目前已被分为200个以上的血清群，只有O1和O139群能引起霍乱流行。本试验分为2个步骤，一是以O1和O139群霍乱弧菌特异性试剂盒检测待测样品中是否存在O1和O139群霍乱弧菌；二是以第1个步骤的检测结果为基础，进一步建立以毒力基因为靶基因的荧光PCR检测方法，检测是否含有毒力基因。结果显示，60个样本中只有2个样本O1群霍乱弧菌与阳性对照样本出现典型的扩增曲线，而其他菌株和空白对照均为无规则的平直曲线，无法读取其Ct值，判定为阴性（图1）。此外，检测O1群霍乱弧菌的6个毒力基因ctx显示阴性（图2）。
2.2 传统方法鉴定结果
在60份样品中共检出2株霍乱弧菌，检出率为3.3%。将两份阳性样本通过分离菌株革兰氏镜检为G-弧菌，在暗视野下作活菌镜检呈流星状运动，加入1滴霍乱免疫血清后运动停止。其中在pH值8.6的碱性蛋白胨溶液中生长良好，6～8 h产生菌膜。在庆大霉素平板上呈中等大小、圆形、较扁平、半透明、光滑、表面湿润、边缘整齐、略带灰色的菌落，中间颜色稍深，呈灰黑色。
氧化酶试验呈阳性，有动力，分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇，产酸不产气，不分解乳糖，V-P试验、靛基质试验呈阳性。分离的2株菌株与霍乱弧菌O1多价诊断血清发生凝集，盐水对照呈阴性。
3 讨论
对于霍乱的日常监测主要包括外环境的监测以及疑似霍乱污染病人的监测，水和海产品检测是外环境的检测重点，因其含有大量弧菌，若以传统方法进行检测往往需要花费大量时间用于霍乱弧菌和其他弧菌的鉴别。荧光定量PCR检测方法的出现，为霍乱弧菌的日常监测提供了一种全新的、更为高效便捷的检测手段，在实际疫情应急诊断应用中，可缩短检测周期，结果更為灵敏准确。
据目前的资料显示，霍乱大流行主要是由O1和O139群霍乱弧菌引起 [2-3]。霍乱弧菌的分布较为广泛，且具有季节性，其流行性主要取新决于不同水环境中霍乱弧菌的生长情况。霍乱毒素（CT）是霍乱弧菌的毒力决定因子之一，本次外环境监测点的生活污水中检测出无毒力的O1群霍乱弧菌为非流行株，该菌一般不会引起爆发性流行性传播。但有研究表明，产毒株和无毒株之间可以通过含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体（CTX5）进行传递。所以适宜的海水环境中的无毒力霍乱弧菌也可能获得毒素基因，具有引起爆发流行的潜在危险[4] 。
随着社会的发展、人们生活水平的提高，对海产品的需求及贸易已不局限于沿海地区，各地卫生和市场部门都应引起重视，及时建立和完善日常准入制度，采取有效手段，做好霍乱弧菌的病原学检测，及时切断感染源及传染途径，防止其通过感染海产品传播，进而控制疫情发生。
参考文献：
[1]罗朝晨，谢一俊，张静.霍乱流行态势及我国霍乱防控中存在的问题[J].传染病信息，2008，1（3）：153.
[2]THOMASJK， RONALDK T.Tcpf is a soluble colonization factor and protect iveantigen secreted by Eltor and classical O1 and O139 Vibrio Cholerae serogroups[J].InfectImmun，2005，73（8）：4461-4470.
[3]PANGB， YANM Y， CUIZG， et al.Genetic diversity of toxigenic And nontox igenic Vibrio Cholerae serogroups O1 and O139 revealed byarray-based comparative genomic hybridization[J].JBacteriol， 2007， 189（13）：4837-4849.
[4]阚飙，祁国明，刘延清，等.霍乱弧菌中存在不含霍乱毒素基因的噬菌体CTXΦ基因组[J].中华微生物学和免疫学杂志，1999，19（3）：175-179.
关键词：霍乱弧菌；荧光定量PCR；检测
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2017.06.005
Real-time fluorescence quantitative PCR detection and analysis ofVibrio cholerae in some marine products in Quanzhou City
ZHUNAG Yue-e
（Quanzhou Medical Technical College， Fujian Province 362000）
Abstract： Vibrio cholerae in some marine products in Quanzhou City was detected by real-time fluorescent quantitative PCR， the specificity test showed that this method could selectively detect Vibrio cholerae O1 and O139 group with good specificity and high sensitivity， and effectively overcome the false positives， and had great guidance on the significance of clinical examination and health inspection combined with the traditional culture method of pathogenic microorganisms. The tested results showed that both two case of detected Vibrio cholerae from tested marine products had no virulence genes CTX， but still needed to strengthen the monitoring to prevent distribution and outbreak of the disease.
Key words： Vibrio cholerae； fluorescent quantitative PCR； detection
霍乱是因霍乱弧菌污染而引起的一种急性腹泻性传染病，主要临床表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水、死亡率高[ 1]，其中，O1和O139两种霍乱弧菌的血清型能够引起疾病暴发，其主要传播途径是通过水源或饮食经口传染。随着荧光定量PCR技术的广泛应用，许多由食源性病菌或者病毒引发的急性中毒都可以在很短的时间内检测出来，具有灵敏、准确、快速、污染少等优点。因此，运用荧光定量PCR等技术建立针对霍乱病菌污染防治的突发群体性公共卫生事件应急体系，以及开展霍乱的流行病学和病原学研究具有重要的科学意义。
1 材料与方法
1.1 检测样本
由泉州市某沿海区疾控中心提供的咸水及淡水鱼类、虾类及贝壳类等水产品样本60份。
1.2 主要仪器与试剂
主要仪器为ABI 7500型定量PCR仪，O1 群和O139群霍乱弧菌诊断血清试剂，庆大琼脂、TCBS等培养基，QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA 提取试剂盒。
1.3 试验方法
1.3.1 增菌 在碱性蛋白胨水中，37℃增菌6～8 h。
1.3.2 核酸提取 取增菌后的待测样品1.0～1.5 mL至无菌离心管，8000 r/min离心4 min，除去上清液，加入DNA提取液50 μL ，振荡混匀后沸水浴5 min，13000 r/min离心5 min；上清液于-20℃保存备用。
1.3.3 检测
（1）将PCR反应液放置至实验室室温平衡，融化后取Taq酶，测试反应体系配制为：PCR反应液22.5 μL+Taq酶0.4 μL 。
（2）加入模板：將事先保存在-20℃的样品核酸提取物解冻，以13000 r/min离心5 min。在每个PCR反应体系中分别加入模板、阴性对照、阳性对照各2 μL，记录相应样品号。
（3）上机扩增、检测区：反应条件为95℃、3 min，1个循环；95℃、5 s，60℃、40 s（信号采集），40个循环。反应体系设为25 μL。对于多通道荧光PCR仪，信号采集时设定为Fam荧光素。
1.4 霍乱弧菌的传统培养方法
霍乱弧菌的分离培养及生化鉴定参照《霍乱诊断标准》（WS289-2008）和《霍乱防治手册》（第五版）。挑取较大、透明、扁平、湿润且边缘整齐的菌落， 分别与多价血清、O139诊断血清等诊断血清进行凝集试验，同时以生理盐水作为阴性对照。
2 结果与分析
2.1 分子检测结果
2.1.1 特异性检测 对霍乱弧菌以及其他7个食源性病菌分别用实时荧光定量PCR方法进行检测。结果显示，霍乱弧菌检测结果呈阳性，其他细菌检测结果均呈阴性。说明该方法不会与其他食源性病菌的检测发生交叉反应，对霍乱弧菌的检测有良好的特异性。 2.1.2 检测结果 霍乱弧菌目前已被分为200个以上的血清群，只有O1和O139群能引起霍乱流行。本试验分为2个步骤，一是以O1和O139群霍乱弧菌特异性试剂盒检测待测样品中是否存在O1和O139群霍乱弧菌；二是以第1个步骤的检测结果为基础，进一步建立以毒力基因为靶基因的荧光PCR检测方法，检测是否含有毒力基因。结果显示，60个样本中只有2个样本O1群霍乱弧菌与阳性对照样本出现典型的扩增曲线，而其他菌株和空白对照均为无规则的平直曲线，无法读取其Ct值，判定为阴性（图1）。此外，检测O1群霍乱弧菌的6个毒力基因ctx显示阴性（图2）。
2.2 传统方法鉴定结果
在60份样品中共检出2株霍乱弧菌，检出率为3.3%。将两份阳性样本通过分离菌株革兰氏镜检为G-弧菌，在暗视野下作活菌镜检呈流星状运动，加入1滴霍乱免疫血清后运动停止。其中在pH值8.6的碱性蛋白胨溶液中生长良好，6～8 h产生菌膜。在庆大霉素平板上呈中等大小、圆形、较扁平、半透明、光滑、表面湿润、边缘整齐、略带灰色的菌落，中间颜色稍深，呈灰黑色。
氧化酶试验呈阳性，有动力，分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇，产酸不产气，不分解乳糖，V-P试验、靛基质试验呈阳性。分离的2株菌株与霍乱弧菌O1多价诊断血清发生凝集，盐水对照呈阴性。
3 讨论
对于霍乱的日常监测主要包括外环境的监测以及疑似霍乱污染病人的监测，水和海产品检测是外环境的检测重点，因其含有大量弧菌，若以传统方法进行检测往往需要花费大量时间用于霍乱弧菌和其他弧菌的鉴别。荧光定量PCR检测方法的出现，为霍乱弧菌的日常监测提供了一种全新的、更为高效便捷的检测手段，在实际疫情应急诊断应用中，可缩短检测周期，结果更為灵敏准确。
据目前的资料显示，霍乱大流行主要是由O1和O139群霍乱弧菌引起 [2-3]。霍乱弧菌的分布较为广泛，且具有季节性，其流行性主要取新决于不同水环境中霍乱弧菌的生长情况。霍乱毒素（CT）是霍乱弧菌的毒力决定因子之一，本次外环境监测点的生活污水中检测出无毒力的O1群霍乱弧菌为非流行株，该菌一般不会引起爆发性流行性传播。但有研究表明，产毒株和无毒株之间可以通过含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体（CTX5）进行传递。所以适宜的海水环境中的无毒力霍乱弧菌也可能获得毒素基因，具有引起爆发流行的潜在危险[4] 。
随着社会的发展、人们生活水平的提高，对海产品的需求及贸易已不局限于沿海地区，各地卫生和市场部门都应引起重视，及时建立和完善日常准入制度，采取有效手段，做好霍乱弧菌的病原学检测，及时切断感染源及传染途径，防止其通过感染海产品传播，进而控制疫情发生。
参考文献：
[1]罗朝晨，谢一俊，张静.霍乱流行态势及我国霍乱防控中存在的问题[J].传染病信息，2008，1（3）：153.
[2]THOMASJK， RONALDK T.Tcpf is a soluble colonization factor and protect iveantigen secreted by Eltor and classical O1 and O139 Vibrio Cholerae serogroups[J].InfectImmun，2005，73（8）：4461-4470.
[3]PANGB， YANM Y， CUIZG， et al.Genetic diversity of toxigenic And nontox igenic Vibrio Cholerae serogroups O1 and O139 revealed byarray-based comparative genomic hybridization[J].JBacteriol， 2007， 189（13）：4837-4849.
[4]阚飙，祁国明，刘延清，等.霍乱弧菌中存在不含霍乱毒素基因的噬菌体CTXΦ基因组[J].中华微生物学和免疫学杂志，1999，19（3）：175-179.