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摘 要目的：旨在探讨氯胺酮在治疗颅脑损伤方面可能的作用机理和应用前景，为临床上治疗颅脑损伤提供用药基础。方法：取大脑受伤部位，制作10%组织匀浆液检测SOD和MDA。结果使用氯胺酮治疗后能使SOD活性下降和MDA值的升高幅度有所降低，氯胺酮治疗组与同时间段的模型对比较，差异显著（P<0.05）。结论：氯胺酮对脑损伤具有一定的保护作用；用氯胺酮治疗24h有较好的效果。
关键词氯胺酮；细胞凋亡；肿瘤坏死因子；白细胞介素；颅脑损伤
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
健康SD (Sprague Dawley) 大鼠70只，体重（230±20）g，雄性，由河南省实验动物中心提供，动物合格证号：医动字410116。大鼠全价饲料由新乡医学院实验动物中心提供。
1.2方法
1.2.1实验分组
SD大鼠70只，适应性喂养3d后，随机分为7组,每组10只。A组(假手术组)；B组(颅脑损伤模型对照组，简称模型组), 再根据伤后时间段分为伤后6h、24h、72h组；C组（颅脑损伤+氯胺酮治療组,简称氯胺酮治疗组）,再根据伤后时间段分为伤后6h、24h、72h组。
1.2.2动物模型的建立
实验采用改进的Feeney自由落体硬膜脊外撞击方法。打击装置自制，由固定支架、玻璃导管、下落击锤和金属垫片组成。下落击锤重20g，下落高度30cm，金属垫片直径5mm。实验前大鼠禁食12h，将大鼠称重后，用10%的水合氯醛腹腔注射（300mg/kg），麻醉成功后将大鼠俯卧固定于解剖台上，剪去大鼠头顶部皮肤的毛发，皮肤消毒后，沿中线左侧切开头皮4cm，分离骨膜，在矢状缝下1～2mm，冠状缝左侧1～2mm，用牙科钻开一直径约为5mm的骨窗，硬脊膜保持完整。用20g击锤从30cm高处通过一玻璃导管坠落，撞击置于硬膜上的圆形金属垫片，使其下端的脑组织发生局限性脑挫裂伤，致伤冲击力为600g•cm，止血处理后缝合头皮，常规喂养,按不同组别设定的时间段取材。氯胺酮治疗组在打击致伤后1h腹腔注射氯胺酮120mg/Kg，在设定的时间段取材。假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不用打击锤致脑损伤，术后6h处死。
1.2.3实验取材、观察指标及检测方法
1.2.3.1脑组织SOD、MDA检测
分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定SOD和MDA。取受伤及周围部位一小块脑组织加9倍生盐水，用玻璃匀浆器置冰水中研磨，3000r/min离心10min，取上清，然后按照试剂盒中说明测定。测SOD时，先通过百分抑制率选择最佳取样量（本次选取样量20ul，抑制率45%），按顺序加试剂一、样品、试剂二、试剂三、试剂四，用漩涡混匀器混匀，置37℃ 恒温水浴40min，加显色剂2ml后混匀，室温放置10min，用721分光光度计于550nm测OD值。同样，MDA测试时，加试剂后试管口用保鲜膜扎紧，刺孔，95℃水浴40min后流水冲洗，离心，取上清于532nm测OD值。用靠马斯亮蓝进行蛋白定量，计算脑组织中每毫克蛋白的MDA和SOD含量。
1.3统计学处理
采用SPSS11.5统计软件进行统计学处理。实验数据计数资料均以均数±标准差（X±s）表示，实验数据经方差齐性检验和t检验，组间比较采用单因素方差分析和方差齐性检验，方差齐时采用t检验，方差不齐时采用t′检验，以 P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1实验动物数量分析
SD大鼠70只，随机分为7组，每组10只，实验中因麻醉药不耐受、打击休克、出血过多等原因动物出现死亡，模型6h组、模型24h组、模型72h组、氯胺酮治疗24h组、氯胺酮治疗72h组大鼠分别死亡1只、2只、1只、2只、1只，完成实验时实验动物分别为：假手术组10只，模型6h组9只，模型24h组8只，模型72h组9只，氯胺酮治疗6h组10只，氯胺酮治疗24h组8只，氯胺酮治疗72h组9只。
2.2氯胺酮对颅脑损伤大鼠脑组织中MDA、SOD的影响
大鼠造成颅脑损伤模型后，脑组织中SOD活性明显降低，MDA值明显升高，模型组与假手术组比较，不同时间段的测量值均有明显差异（P<0.01）。而使用氯胺酮治疗后能使SOD活性下将和MDA值的升高幅度有所降低，氯胺酮治疗6h组、24 h组、72h组与同时间段的模型6h组、模型24 h组、模型72h组比较，差异明显（P<0.05）。（见表1）
注：与假手术组比较，a P<0.01；与同时段模型组比较，bP<0.05
3讨论
3.1颅脑损伤大鼠脑组织SOD和MDA及氯胺酮对它们的影响
氧自由基广泛存在于各种生物体中，性质活泼，可与生物大分子，特别是细胞膜上的不饱和脂肪酸结合，形成脂质过氧化物(lpo)， 破坏生物膜[1]。SOD是生物体内专一清除超氧阴离子自由基(O-2)的特异性抗氧化酶，可有效清除体内过多的O-2，以保持O-2的动态平衡，阻断由过多O-2所引起的一系列氧自由基病理反应[2]。MDA是超氧化物阴离子自由基作用于生物膜磷脂结构不饱和脂肪酸所形成的终产物之一，其产生的量与氧自由基的量相平衡，其含量多少可间接反应自由基对组织细胞损伤强度，因而测定MDA的量可反映氧自由基的含量，在一定程度上反映组织细胞损伤的程度。MDA为一种重要的大分子交联剂，能交联蛋白质与核酸，使DNA发生突变，影响信息传递、转录和复制，从而导致蛋白质合成能力的下降或合成蛋白质功能紊乱，同时使自由基清除剂的关键酶超氧化物歧化酶(SOD)生成减少、活性降低，从而导致组织损伤[3]。
颅脑损伤后，全脑血管痉挛导致脑缺血，随后出现脑血管扩张，血液再灌注。缺血再灌注过程中产生大量氧自由基，使自由基的生成和清除系统动态平衡被打破，自由基蓄积增多，大量的氧自由基作用于生物膜发生脂质过氧化，产生丙二醛(MDA)等有毒醛基产物，攻击细胞膜及细胞内结构，导致其结构破坏、功能丧失。中枢神经系统中大量膜结构的完整性因膜磷脂过氧化而破坏，以致细胞通透性改变，内环境受影响，引起细胞损伤和死亡[4-6]。
氯胺酮是一种传统的麻醉剂。近年来，随着对其作用机制的不断研究，发现它还具有抗炎作用，同时对缺血缺氧造成的器官损害具有一定的保护作用[7,8]。魏兴等[9]用液氮建立大鼠冻伤模型,然后用不同剂量的氯胺酮进行治疗,发现氯胺酮治疗组大鼠脑组织SOD、MDA和SOD/MDA量较未治疗组均有明显改善，提示氯胺酮可通过NMDA受体阻滞作用减少钙内流，减少自由基产生，同时也能减轻冻伤脑组织SOD活力受制，达到减轻脑损伤的作用。本实验研究采用自由落体硬膜外撞击致大鼠颅脑损伤，伤后1小时用氯胺酮治疗，发现损伤后大鼠脑组织中SOD活力持续下降，MDA值持续升高，用氯胺酮治疗，伤后6h、伤后24h、伤后72h组时与同时段的模型组比较，有明显改善（P<0.05）。氯胺酮为非竞争性NMDA受体拮抗剂，可以与NMDA受体通道复合物的PCF调节位点结合，通过结构调节，影响受体识别位点的特性，干扰了兴奋性氨基酸与NMDA受体的正常结合并减少NMDA受体介导的Ca2+内流，从而减低了谷氨酸及细胞内Ca2+超载对组织细胞的损害[10]。也有研究者[11]认为氯胺酮可能通过抑制中性粒细胞激话而抑制过氧化物的生成。氯胺酮治疗的脑损伤大鼠SOD活力下降和MDA值升高幅度下降，氯胺酮可能是通过抑制自由基的产生或直接清除自由基，抑制脂质过氧化反应，减少SOD的消耗，从而降低自由基代谢终产物MDA的值，起到保护脑组织，减轻继发性损伤。
4结论
氯胺酮能减少脑损伤后自由基产生，抑制炎症反应，减轻继发性损伤。
参考文献
[1] 赵成之、陈建良. 急性颅脑损伤的流行病学研究进展[J].中华神经医学杂志,2006,3(5): 319-321.
[2] McNair ND. Traumatic brain injury[J]. Nurs Clin North Am, 1999, 34(3): 637-659.
[3] 卢天喜、陈水群、任安州,等. 开放性与闭合性颅脑损伤病死率比较[J]. 实用医学杂志,2001,17(6): 566.
[4] Kamm K, Vanderkolk W, Lawrence C, et al. The effects of traumatic brain injury upon the concentration and expression of interleukin-1 beta and interleukin-10 in the rat [J]. Trauma, 2006, 60(1): 152-157.
[5] Shi J, Miles DK, Orr BA, et al. Injury-induced neurogenesis in Bax-deficient mice: evidence for regulation by voltage-gated potassium channels [J]. Eur Neurosci, 2007, 25(12): 3499-3512.
[6] 沈世琴、 朱京慈. 霧化吸入γIFN对大鼠重型颅脑损伤继发肺损伤支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6水平的影[J]. 创伤外科杂志, 2006, 8(3): 241-244.
[7] Marklund N, Keck C, Hoover R, et al. Administration of monoclonal antibodies neutralizing the inflammatory mediators tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 does not attenuate acute behavioral deficits following experimental traumatic brain injury in the rat [J]. Restor Neurol Neurosci, 2005, 23(1): 31-42.
[8] Rink A, Fung KM, Trojanowski JQ, et al. Evidence of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat [J]. Am Pathol, 1995, 147(6):1575-1583.
[9] 杨小锋、李 谷、刘伟国. 严重颅脑损伤后细胞凋亡状态及相关基因Bcl-2、Bax的表达[J]. 中华急诊医学杂志,2004,13(2): 100-103.
[10] Himmelseher S, Durieux ME. Revising a dogma: ketamine for patients with neurological injury? [J]. Anesth Analg, 2005, 101(2): 524-534.
[11] 汪云春、付铁娟、赵智宇,等. 亚低温对大鼠局灶性脑缺血氧自由基和一氧化氮的影响[J].中国老年学杂志,2007, 5(27): 991-993.
关键词氯胺酮；细胞凋亡；肿瘤坏死因子；白细胞介素；颅脑损伤
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
健康SD (Sprague Dawley) 大鼠70只，体重（230±20）g，雄性，由河南省实验动物中心提供，动物合格证号：医动字410116。大鼠全价饲料由新乡医学院实验动物中心提供。
1.2方法
1.2.1实验分组
SD大鼠70只，适应性喂养3d后，随机分为7组,每组10只。A组(假手术组)；B组(颅脑损伤模型对照组，简称模型组), 再根据伤后时间段分为伤后6h、24h、72h组；C组（颅脑损伤+氯胺酮治療组,简称氯胺酮治疗组）,再根据伤后时间段分为伤后6h、24h、72h组。
1.2.2动物模型的建立
实验采用改进的Feeney自由落体硬膜脊外撞击方法。打击装置自制，由固定支架、玻璃导管、下落击锤和金属垫片组成。下落击锤重20g，下落高度30cm，金属垫片直径5mm。实验前大鼠禁食12h，将大鼠称重后，用10%的水合氯醛腹腔注射（300mg/kg），麻醉成功后将大鼠俯卧固定于解剖台上，剪去大鼠头顶部皮肤的毛发，皮肤消毒后，沿中线左侧切开头皮4cm，分离骨膜，在矢状缝下1～2mm，冠状缝左侧1～2mm，用牙科钻开一直径约为5mm的骨窗，硬脊膜保持完整。用20g击锤从30cm高处通过一玻璃导管坠落，撞击置于硬膜上的圆形金属垫片，使其下端的脑组织发生局限性脑挫裂伤，致伤冲击力为600g•cm，止血处理后缝合头皮，常规喂养,按不同组别设定的时间段取材。氯胺酮治疗组在打击致伤后1h腹腔注射氯胺酮120mg/Kg，在设定的时间段取材。假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不用打击锤致脑损伤，术后6h处死。
1.2.3实验取材、观察指标及检测方法
1.2.3.1脑组织SOD、MDA检测
分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定SOD和MDA。取受伤及周围部位一小块脑组织加9倍生盐水，用玻璃匀浆器置冰水中研磨，3000r/min离心10min，取上清，然后按照试剂盒中说明测定。测SOD时，先通过百分抑制率选择最佳取样量（本次选取样量20ul，抑制率45%），按顺序加试剂一、样品、试剂二、试剂三、试剂四，用漩涡混匀器混匀，置37℃ 恒温水浴40min，加显色剂2ml后混匀，室温放置10min，用721分光光度计于550nm测OD值。同样，MDA测试时，加试剂后试管口用保鲜膜扎紧，刺孔，95℃水浴40min后流水冲洗，离心，取上清于532nm测OD值。用靠马斯亮蓝进行蛋白定量，计算脑组织中每毫克蛋白的MDA和SOD含量。
1.3统计学处理
采用SPSS11.5统计软件进行统计学处理。实验数据计数资料均以均数±标准差（X±s）表示，实验数据经方差齐性检验和t检验，组间比较采用单因素方差分析和方差齐性检验，方差齐时采用t检验，方差不齐时采用t′检验，以 P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1实验动物数量分析
SD大鼠70只，随机分为7组，每组10只，实验中因麻醉药不耐受、打击休克、出血过多等原因动物出现死亡，模型6h组、模型24h组、模型72h组、氯胺酮治疗24h组、氯胺酮治疗72h组大鼠分别死亡1只、2只、1只、2只、1只，完成实验时实验动物分别为：假手术组10只，模型6h组9只，模型24h组8只，模型72h组9只，氯胺酮治疗6h组10只，氯胺酮治疗24h组8只，氯胺酮治疗72h组9只。
2.2氯胺酮对颅脑损伤大鼠脑组织中MDA、SOD的影响
大鼠造成颅脑损伤模型后，脑组织中SOD活性明显降低，MDA值明显升高，模型组与假手术组比较，不同时间段的测量值均有明显差异（P<0.01）。而使用氯胺酮治疗后能使SOD活性下将和MDA值的升高幅度有所降低，氯胺酮治疗6h组、24 h组、72h组与同时间段的模型6h组、模型24 h组、模型72h组比较，差异明显（P<0.05）。（见表1）
注：与假手术组比较，a P<0.01；与同时段模型组比较，bP<0.05
3讨论
3.1颅脑损伤大鼠脑组织SOD和MDA及氯胺酮对它们的影响
氧自由基广泛存在于各种生物体中，性质活泼，可与生物大分子，特别是细胞膜上的不饱和脂肪酸结合，形成脂质过氧化物(lpo)， 破坏生物膜[1]。SOD是生物体内专一清除超氧阴离子自由基(O-2)的特异性抗氧化酶，可有效清除体内过多的O-2，以保持O-2的动态平衡，阻断由过多O-2所引起的一系列氧自由基病理反应[2]。MDA是超氧化物阴离子自由基作用于生物膜磷脂结构不饱和脂肪酸所形成的终产物之一，其产生的量与氧自由基的量相平衡，其含量多少可间接反应自由基对组织细胞损伤强度，因而测定MDA的量可反映氧自由基的含量，在一定程度上反映组织细胞损伤的程度。MDA为一种重要的大分子交联剂，能交联蛋白质与核酸，使DNA发生突变，影响信息传递、转录和复制，从而导致蛋白质合成能力的下降或合成蛋白质功能紊乱，同时使自由基清除剂的关键酶超氧化物歧化酶(SOD)生成减少、活性降低，从而导致组织损伤[3]。
颅脑损伤后，全脑血管痉挛导致脑缺血，随后出现脑血管扩张，血液再灌注。缺血再灌注过程中产生大量氧自由基，使自由基的生成和清除系统动态平衡被打破，自由基蓄积增多，大量的氧自由基作用于生物膜发生脂质过氧化，产生丙二醛(MDA)等有毒醛基产物，攻击细胞膜及细胞内结构，导致其结构破坏、功能丧失。中枢神经系统中大量膜结构的完整性因膜磷脂过氧化而破坏，以致细胞通透性改变，内环境受影响，引起细胞损伤和死亡[4-6]。
氯胺酮是一种传统的麻醉剂。近年来，随着对其作用机制的不断研究，发现它还具有抗炎作用，同时对缺血缺氧造成的器官损害具有一定的保护作用[7,8]。魏兴等[9]用液氮建立大鼠冻伤模型,然后用不同剂量的氯胺酮进行治疗,发现氯胺酮治疗组大鼠脑组织SOD、MDA和SOD/MDA量较未治疗组均有明显改善，提示氯胺酮可通过NMDA受体阻滞作用减少钙内流，减少自由基产生，同时也能减轻冻伤脑组织SOD活力受制，达到减轻脑损伤的作用。本实验研究采用自由落体硬膜外撞击致大鼠颅脑损伤，伤后1小时用氯胺酮治疗，发现损伤后大鼠脑组织中SOD活力持续下降，MDA值持续升高，用氯胺酮治疗，伤后6h、伤后24h、伤后72h组时与同时段的模型组比较，有明显改善（P<0.05）。氯胺酮为非竞争性NMDA受体拮抗剂，可以与NMDA受体通道复合物的PCF调节位点结合，通过结构调节，影响受体识别位点的特性，干扰了兴奋性氨基酸与NMDA受体的正常结合并减少NMDA受体介导的Ca2+内流，从而减低了谷氨酸及细胞内Ca2+超载对组织细胞的损害[10]。也有研究者[11]认为氯胺酮可能通过抑制中性粒细胞激话而抑制过氧化物的生成。氯胺酮治疗的脑损伤大鼠SOD活力下降和MDA值升高幅度下降，氯胺酮可能是通过抑制自由基的产生或直接清除自由基，抑制脂质过氧化反应，减少SOD的消耗，从而降低自由基代谢终产物MDA的值，起到保护脑组织，减轻继发性损伤。
4结论
氯胺酮能减少脑损伤后自由基产生，抑制炎症反应，减轻继发性损伤。
参考文献
[1] 赵成之、陈建良. 急性颅脑损伤的流行病学研究进展[J].中华神经医学杂志,2006,3(5): 319-321.
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[4] Kamm K, Vanderkolk W, Lawrence C, et al. The effects of traumatic brain injury upon the concentration and expression of interleukin-1 beta and interleukin-10 in the rat [J]. Trauma, 2006, 60(1): 152-157.
[5] Shi J, Miles DK, Orr BA, et al. Injury-induced neurogenesis in Bax-deficient mice: evidence for regulation by voltage-gated potassium channels [J]. Eur Neurosci, 2007, 25(12): 3499-3512.
[6] 沈世琴、 朱京慈. 霧化吸入γIFN对大鼠重型颅脑损伤继发肺损伤支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6水平的影[J]. 创伤外科杂志, 2006, 8(3): 241-244.
[7] Marklund N, Keck C, Hoover R, et al. Administration of monoclonal antibodies neutralizing the inflammatory mediators tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 does not attenuate acute behavioral deficits following experimental traumatic brain injury in the rat [J]. Restor Neurol Neurosci, 2005, 23(1): 31-42.
[8] Rink A, Fung KM, Trojanowski JQ, et al. Evidence of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat [J]. Am Pathol, 1995, 147(6):1575-1583.
[9] 杨小锋、李 谷、刘伟国. 严重颅脑损伤后细胞凋亡状态及相关基因Bcl-2、Bax的表达[J]. 中华急诊医学杂志,2004,13(2): 100-103.
[10] Himmelseher S, Durieux ME. Revising a dogma: ketamine for patients with neurological injury? [J]. Anesth Analg, 2005, 101(2): 524-534.
[11] 汪云春、付铁娟、赵智宇,等. 亚低温对大鼠局灶性脑缺血氧自由基和一氧化氮的影响[J].中国老年学杂志,2007, 5(27): 991-993.