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目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种中枢神经系统的慢性自身免疫性疾病。青年患者多见,女性发病率高于男性。绝大多数多发性硬化患者临床特征呈病变部位的空间多发性和病程复发缓解交替的时间多发性。多发性硬化病理表现主要以轴突损伤或丢失、白质脱髓鞘和慢性神经炎症为主。虽然经历了很长时间的探索,但目前临床确诊多发性硬化疾病比较困难,鉴别诊断也非常复杂,发病机制仍未完全明确,这也限制了多发性硬化治疗手段的发展。炎性小体是一种多蛋白复合体,其形成和活化与多种炎症反应的启动过程密切相关。NLRP3炎性小体在中枢神经系统中表达量相对较高,与很多中枢神经系统疾病发病有关,也是目前研究最深入的炎性小体。细胞焦亡是一种新发现的细胞死亡方式,又称细胞炎性坏死,是由炎性小体介导的细胞程序性死亡,并且与小胶质细胞异常激活有关。有研究发现NLRP3炎性小体信号通路和细胞焦亡可能是多发性硬化的发病机制之一。Ghrelin是一种由28个氨基酸组成的胃肠道激素,也是生长激素促分泌受体(growth hormone secretagogue receptor,GHSR)的内源性配体。Ghrelin具有多种内分泌调节功能,它可以促进生长激素分泌、控制食物摄入和维持能量稳态,越来越多的研究表明,ghrelin也可以在中枢神经系统中作为神经肽发挥神经保护的功能。本研究中利用豚鼠脊髓匀浆作为免疫原建立多发性硬化的动物模型,即实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型,探究ghrelin能否缓解EAE疾病进展,其机制是否与ghrelin调节NLRP3炎性小体信号通路有关,并为多发性硬化的治疗提供新方法。研究方法:本研究首先利用豚鼠脊髓匀浆作为免疫原建立多发性硬化的动物模型,观察并记录SD大鼠每日临床表现变化情况,以判断造模是否成功。将SD大鼠随机分为以下4组:健康对照组;EAE模型组;EAE+ghrelin治疗组;ghrelin对照组。每天记录各组大鼠体重变化、行为学评分,并用H&E染色和LFB染色观察各组神经组织炎症浸润情况和脱髓鞘损伤情况,初步探究ghrelin能否在多发性硬化中发挥神经保护作用。在此基础上,本研究利用PCR、ELISA和免疫组化染色等方法,检测脊髓组织和血清中相关炎性因子的表达水平以及小胶质细胞的活性,进一步明确ghrelin在EAE中的抗炎作用。最后,本研究利用PCR、ELISA和western blot等方法,检测ghrelin治疗前后NLRP3信号通路和细胞焦亡过程所涉及到的重要蛋白和细胞因子的变化情况,深入探究ghrelin治疗EAE的潜在机制。结果:1、利用豚鼠脊髓匀浆建立EAE动物模型后,体重和行为学评分监测表明大鼠平均第9天开始发病,第13-14天进入疾病高峰期,疾病进程符合实验要求,为后续实验奠定基础。经连续皮下注射ghrelin后,与未接受治疗的EAE组相比,大鼠体重减轻出现时间较晚,神经行为学评分得到明显改善。除此之外,H&E和LFB染色结果表明,经ghrelin治疗后,大鼠脑组织炎症浸润以及脊髓脱髓鞘损伤程度也得到缓解。2、与正常对照组相比,EAE大鼠脊髓组织中TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS的mRNA相对表达量明显升高,血清中TNF-α、IL-6和NO也呈高表达。经ghrelin治疗后,上述细胞因子表达水平下降。以上结果进一步证实了ghrelin的抗炎作用。免疫组化染色实验结果显示,EAE组CD68和iba-1表达水平明显高于健康对照组,经ghrelin治疗后,组织中iba-1和CD68阳性水平明显降低。以上结果证实ghrelin能够抑制炎症反应中小胶质细胞的异常聚集和活化,说明ghrelin调节小胶质细胞的活性是其治疗EAE的潜在机制之一。除此之外,ghrelin对照组中细胞因子表达处于较低水平,CD68和iba-1表达量也较低,说明了ghrelin对健康大鼠体内的免疫状态不造成影响。3、与健康对照组相比,EAE组大鼠NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对表达水平均显著上升,经ghrelin治疗后,上述相关蛋白的表达水平显著降低。以上结果提示ghrelin能够抑制NLRP3炎性小体信号通路。除此之外,ghrelin显著抑制了血清中LDH以及组织中GSDMD的表达水平,说明ghrelin可以抑制EAE疾病期细胞焦亡的发生。ghrelin处理组的EAE大鼠中NF-κB p-P65较低,这提示Ghrelin也可以通过调控NF-κB磷酸化水平抑制其活性,进而抑制NLRP3炎症小体信号途径。结论:1、Ghrelin在豚鼠脊髓匀浆作为免疫原的EAE大鼠模型中产生神经保护作用。Ghrelin可以缓解EAE模型大鼠发病时间以及临床症状,改善大鼠神经功能,减轻组织的炎症浸润情况及脱髓鞘损伤,且本实验所用ghrelin剂量对大鼠尚无其他干扰作用;2、Ghrelin缓解EAE的作用可能与其能够调节小胶质细胞的活性有关。Ghrelin显著降低组织和血液中主要炎症因子的表达水平,抑制脑实质中小胶质细胞的聚集和活化,且对健康大鼠体内的免疫状态不造成影响;3、Ghrelin对EAE模型的治疗作用与其抑制NLRP3炎性小体信号通路和细胞焦亡有密切关系,ghrelin抑制NF-κB P65磷酸化可能是其能够调控NLRP3炎性小体信号通路的潜在机制。