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【摘 要】目的：研究体外培养人胚胎干细胞的生物学特征，初步探讨人胚胎干细胞向成骨细胞定向分化的特性，为后续成骨细胞移植治疗研究提供很好的资源。方法：体外传代培养人胚胎干细胞，显微镜观察细胞的贴壁生长情况，细胞染色体检查确认核型，免疫荧光染色检测人胚胎干细胞的异性和细胞周期，进行成骨诱导分化及碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定。结果：人胚胎干细胞在体外培养体系中增殖迅速，核型检测为46，XX，免疫荧光染色检测细胞表达人胚胎干细胞特异性标志，细胞周期检测结果显示细胞的增殖能力强，大部分细胞处于 G1期。人胚胎干细胞经成骨诱导分化后，碱性磷酸酶染色和茜素红染色阳性。结论：在特殊培养条件下，人胚胎干细胞在体外能维持其多能特性，体外可以诱导分化成为骨细胞，有望促进应用于骨组织工程移植治疗的机制探讨。
【关键词】人胚胎干细胞；生物学特性；成骨诱导分化
【中图分类号】R329 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）02-0059-03
人胚胎干细胞（human embryonic stem cell， hESC）由内细胞团（inner cell mass， ICM）分离培养而得，其在体外能保持多能特性和向各个胚层细胞分化的潜能[1]，并能诱导分化为特定方向的细胞和组织，这在基因治疗、组织工程学、药学研究等众多领域具有广泛的应用价值[2]。在hESC的建系过程中，研究人员不断寻找分离获取各种ES细胞的最佳时期；探讨ES细胞的高效增殖和有效抑制其分化，但是在这过程中很容易出现非整倍体核型。目前很多研究利用工程化组织进行骨缺损治疗，将分离获得的间充质干细胞在体外用特定的培养条件在体外扩增，接种到三维构建的支架材料中，进行成骨分化诱导后填充到病人损坏处以达到促进组织修复及再生的目的。本研究通过在体外培养hESC，建立一套稳定的hESC培养体系，并对其生物学特性进行初步研究，为后续研究组织修复及再生提供和良好的基础条件。
1 材料和方法
1.1 材料和主要仪器试剂
1.1.1 标本来源：样本由南方医科大学提供。
1.1.2 主要试剂：knockout-Dulbecco （DMEM），FBS（胎牛血清），beta-mercaptoethanol（β-巯基乙醇），β-磷酸甘油酯，Glutamax（谷氨酰胺），Non‐essential amino acids（NEAA），0.25%Trypsin/EDTA（胰酶），维生素C，Pen/Strep（双抗），地塞米松，购自美国Invitrogen Gibco公司 ；碱性磷酸酶染色液（BCIP/NBT）购自武汉博士德生物工程有限公司，茜素红S试剂盒（GENMED）。
1.1.3 主要仪器和设备：超净工作台、二氧化碳培养箱（Forma）、体视镜（Nikon）、离心机（德国）、恒温水浴锅、冰箱（海尔）、移液枪（Eppendorf，德国）、培养皿（corning）、EP管、锥形离心管（corning），流式细胞仪（BD），荧光共聚焦（Nikon）。
2 方法
2.1 人胚胎干细胞（hESC）传代
用Dispase（1mg/ml）消化5-10分钟后传代，每天半量换液， 4-5天进行传代一次。 hESC培养液配方：在knockout-Dulbecco （DMEM） 中添加20% 血清替代物，0.1mmol/L非必需氨基酸，0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇，2 mmol/L谷氨酰胺，100 units/ml Pen/Strep（双抗），5ng/ml bFGF和2000 U/ml hLIF（以上均购自美国Gibco公司）。
2.2 人胚胎干细胞特征鉴定
2.2.1 碱性磷酸酶（AP）染色：去除hESC液，用PBS洗2遍； 4%多聚甲醛固定10分钟；PBS液洗2遍；加入碱性磷酸酶孵育液（博士德），避光孵育30分钟；PBS液洗2遍，光镜下观察结果。
2.2.2 免疫組织化学检测：去除hESC液，PBS洗2遍；4%多聚甲醛固定30分钟；PBS冲洗3遍，每次5分钟；0.1%TritonX-100/PBS通透10分钟；加入4%山羊血清室温孵育1小时；滴加一抗SSEA-3SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、OCT4（ 以上均购自Abcam） （PBS液1：100稀释）4度过夜；PBS冲洗3遍，每次5分钟；加入荧二抗光标记（FITC） （Invitrogen）4度过夜；PBS冲洗3遍，每次5分钟；DAPI进行核染色1小时；PBS覆盖后观察结果。
2.2.3 染色体核型分析：hESCs消化传代后第二天，0.25mg/l秋水仙素作用4小时，0.25% 胰蛋白酶消化细胞成单细胞，1000r/min，离心5min，去上清，37℃水浴低渗5min，固定液（ 甲醇：冰醋酸=3：1 ） 预固定，离心5min，弃上清液，加固定液4mL固定两次，每次40分钟。滴片，65℃烤箱过夜，Giemsa染色干燥后，分析20个分裂中期的细胞核型。
2.2.4 成骨诱导分化实验：调整hESCs的密度为 5×104/ml，让其贴壁培养，24h后换成骨诱导培养液，以后每3d换液 1次，培养3周。成骨诱导培养液：DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）、100 units/ml双抗（penicillin-streptomycin）、10umol/Lβ-磷酸甘油酯、50umol/L维生素C0.1umol/L地塞米松、。
hESCs在成骨诱导培养基诱导分化2周后，进行碱性磷酸酶染色。弃去hESC培养基， PBS 洗2次；4% 多聚甲醛固定5分钟，PBS洗2遍，加入碱性磷酸酶染色液（博士德），室温孵育30分钟以上至染色满意，后显微镜下观察拍照。
经过3周的成骨诱导分化后，做茜素红染色。按GENMED细胞茜素红钙染色试剂盒说明书进行操作，弃去培养基，用清理液A洗1遍，固定液B室温下固定10min，清理液A洗2遍，染色液C室温孵育2min，吸弃染色液C，空气中晾干，显微镜下观察照相。 3 结果
3.1 hESC特征鉴定
传代培养的hESC形态显示核大而明显，核质比高，有一个或多个核仁，能维持典型的未分化形态学特征，在体外培养时集落边界清晰可见；碱性磷酸酶活性呈强阳性；人早期胚胎阶段特异性抗原SSEA-3， SSEA-4表达阳性；未分化标记物OCT4呈阳性表达（图1A-E）。
3.2 AFMSCs细胞周期测定
流式细胞仪检测结果显示第4代hESC细胞G1，S和，G2期的细胞所占百分比分别为 86.20% 6.35% 和7.45%（图2）。
3.3 染色体核型分析
对体外培养的hESC进行染色体核型检测，为46，XX（图2）。
3.3 成骨诱导分化实验
hESC经成骨培养基诱导后，细胞形态发生明显改变。2w后做碱性磷酸酶染色，镜下观察，胞质中呈现灰黑色沉淀；3w后做细胞茜素红S染色，镜下可见细胞浆中出现大量深红色化合物，钙结节被染成红色（图4）。
4 讨论
人胚胎干细胞（hESCs），能够自我更新和多向分化的生物学特性， 能诱导分化为多个胚层的细胞具有重要的医学价值，在基因治疗、组织工程学、药学研究等许多领域都具有广泛的应用。利用培育的干细胞来实现组织再生和器官修复对于许多重大疾病如老年性痴呆、糖尿病、帕金森病、心脏疾病、神经损伤等的治疗具有重要意义，同时也是新药研发的重要工具。
很多学者在体外扩增间充质干细胞，并在三维培养皿中进行培养和诱导分化[3]，同时也有利用微载体和生物反应器系统进行种子细胞的扩增[4，5]。但是有研究指出，利用动态培养系统对间充质干细胞进行工程化骨组织构建，优于静态培养和诱导体系，并有利于提高干细胞成骨分化的分化率，碱性磷酸酶活性、胞外钙基质沉积和骨桥蛋白分泌等[6]。
器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的，是一个非常复杂的三维过程。 hESC在体外发育成一完整的器官 ，像肝、心、肺等大型精细复杂的器官这一目标需要很大技术上的突破。目前要离体培养并维持其组织器官正常的生理功能目前还无法做到，器官的体外保存和维持更是器官移植的巨大难题。本实验体外培养的hESC表达人早期胚胎阶段特异性抗原；表达与多能性有关的关键蛋白如oct4；体外长期培养可以维持干细胞的多能性特征和正常的核型特征，证明我们建立的消化、传代、培养体系可以很好地满足hESC的生长需要。
hESC最快可能应用于临床的层次是细胞替代治疗，这需要组织工程学的配合。本实验在hESC培养基中添加成骨诱导剂，体外诱导培养2周，碱性磷酸酶染色阳性；接着让其继续诱导培养至第3周时，茜素红染色时可见明显钙结节形成，证明本实验方法可以促使干细胞能向成骨细胞分化，这為后续研究组织修复及再生提供很好的基础。
参考文献：
[1] Thomson JA， Itskovitz-Eldor J， Shapiro SS， Waknitz MA， Swiergiel JJ， et al. （1998） Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282： 1145-1147.
[2] Lim UM， Sidhu KS， Tuch BE （2006） Derivation of Motor Neurons from three Clonal Human Embryonic Stem Cell Lines. Curr Neurovasc Res 3： 281-288.
[3] Banf A，Bianchi G Notaro R et al （2002） Replicative aging and gene expression in long·term cultures ofhuman bone marrow stromal cells. Tissue Eng，8（6）：901-91 0
[4] Sun L Y Hsieh D K，Syu W S，et al （2010） Cell proliferation of human bone marow mesenchymal stem cells on biodegradable microcarriers enhances in vitro diferentiation potential[J] Cell Prolif，43（5）：445-456.
[5] FAN Xiu·bo，SONG Ke-dong，LIU Tian-qing，et al （2010） Simultaneous expansion and harvest of hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood [J].JChemEng ofChineseUniv，24（5）：808-81 8
[6] Holtorf H L，Jansen J A，Mikos A G （2005） Flow perfusion culture induces the osteoblastic diferentiation of marrow stromal cell—scafold constructs in the absence of dexamethasone J1_J Biomed Mater Res Part A， 72（3）：326-334
【关键词】人胚胎干细胞；生物学特性；成骨诱导分化
【中图分类号】R329 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）02-0059-03
人胚胎干细胞（human embryonic stem cell， hESC）由内细胞团（inner cell mass， ICM）分离培养而得，其在体外能保持多能特性和向各个胚层细胞分化的潜能[1]，并能诱导分化为特定方向的细胞和组织，这在基因治疗、组织工程学、药学研究等众多领域具有广泛的应用价值[2]。在hESC的建系过程中，研究人员不断寻找分离获取各种ES细胞的最佳时期；探讨ES细胞的高效增殖和有效抑制其分化，但是在这过程中很容易出现非整倍体核型。目前很多研究利用工程化组织进行骨缺损治疗，将分离获得的间充质干细胞在体外用特定的培养条件在体外扩增，接种到三维构建的支架材料中，进行成骨分化诱导后填充到病人损坏处以达到促进组织修复及再生的目的。本研究通过在体外培养hESC，建立一套稳定的hESC培养体系，并对其生物学特性进行初步研究，为后续研究组织修复及再生提供和良好的基础条件。
1 材料和方法
1.1 材料和主要仪器试剂
1.1.1 标本来源：样本由南方医科大学提供。
1.1.2 主要试剂：knockout-Dulbecco （DMEM），FBS（胎牛血清），beta-mercaptoethanol（β-巯基乙醇），β-磷酸甘油酯，Glutamax（谷氨酰胺），Non‐essential amino acids（NEAA），0.25%Trypsin/EDTA（胰酶），维生素C，Pen/Strep（双抗），地塞米松，购自美国Invitrogen Gibco公司 ；碱性磷酸酶染色液（BCIP/NBT）购自武汉博士德生物工程有限公司，茜素红S试剂盒（GENMED）。
1.1.3 主要仪器和设备：超净工作台、二氧化碳培养箱（Forma）、体视镜（Nikon）、离心机（德国）、恒温水浴锅、冰箱（海尔）、移液枪（Eppendorf，德国）、培养皿（corning）、EP管、锥形离心管（corning），流式细胞仪（BD），荧光共聚焦（Nikon）。
2 方法
2.1 人胚胎干细胞（hESC）传代
用Dispase（1mg/ml）消化5-10分钟后传代，每天半量换液， 4-5天进行传代一次。 hESC培养液配方：在knockout-Dulbecco （DMEM） 中添加20% 血清替代物，0.1mmol/L非必需氨基酸，0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇，2 mmol/L谷氨酰胺，100 units/ml Pen/Strep（双抗），5ng/ml bFGF和2000 U/ml hLIF（以上均购自美国Gibco公司）。
2.2 人胚胎干细胞特征鉴定
2.2.1 碱性磷酸酶（AP）染色：去除hESC液，用PBS洗2遍； 4%多聚甲醛固定10分钟；PBS液洗2遍；加入碱性磷酸酶孵育液（博士德），避光孵育30分钟；PBS液洗2遍，光镜下观察结果。
2.2.2 免疫組织化学检测：去除hESC液，PBS洗2遍；4%多聚甲醛固定30分钟；PBS冲洗3遍，每次5分钟；0.1%TritonX-100/PBS通透10分钟；加入4%山羊血清室温孵育1小时；滴加一抗SSEA-3SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、OCT4（ 以上均购自Abcam） （PBS液1：100稀释）4度过夜；PBS冲洗3遍，每次5分钟；加入荧二抗光标记（FITC） （Invitrogen）4度过夜；PBS冲洗3遍，每次5分钟；DAPI进行核染色1小时；PBS覆盖后观察结果。
2.2.3 染色体核型分析：hESCs消化传代后第二天，0.25mg/l秋水仙素作用4小时，0.25% 胰蛋白酶消化细胞成单细胞，1000r/min，离心5min，去上清，37℃水浴低渗5min，固定液（ 甲醇：冰醋酸=3：1 ） 预固定，离心5min，弃上清液，加固定液4mL固定两次，每次40分钟。滴片，65℃烤箱过夜，Giemsa染色干燥后，分析20个分裂中期的细胞核型。
2.2.4 成骨诱导分化实验：调整hESCs的密度为 5×104/ml，让其贴壁培养，24h后换成骨诱导培养液，以后每3d换液 1次，培养3周。成骨诱导培养液：DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）、100 units/ml双抗（penicillin-streptomycin）、10umol/Lβ-磷酸甘油酯、50umol/L维生素C0.1umol/L地塞米松、。
hESCs在成骨诱导培养基诱导分化2周后，进行碱性磷酸酶染色。弃去hESC培养基， PBS 洗2次；4% 多聚甲醛固定5分钟，PBS洗2遍，加入碱性磷酸酶染色液（博士德），室温孵育30分钟以上至染色满意，后显微镜下观察拍照。
经过3周的成骨诱导分化后，做茜素红染色。按GENMED细胞茜素红钙染色试剂盒说明书进行操作，弃去培养基，用清理液A洗1遍，固定液B室温下固定10min，清理液A洗2遍，染色液C室温孵育2min，吸弃染色液C，空气中晾干，显微镜下观察照相。 3 结果
3.1 hESC特征鉴定
传代培养的hESC形态显示核大而明显，核质比高，有一个或多个核仁，能维持典型的未分化形态学特征，在体外培养时集落边界清晰可见；碱性磷酸酶活性呈强阳性；人早期胚胎阶段特异性抗原SSEA-3， SSEA-4表达阳性；未分化标记物OCT4呈阳性表达（图1A-E）。
3.2 AFMSCs细胞周期测定
流式细胞仪检测结果显示第4代hESC细胞G1，S和，G2期的细胞所占百分比分别为 86.20% 6.35% 和7.45%（图2）。
3.3 染色体核型分析
对体外培养的hESC进行染色体核型检测，为46，XX（图2）。
3.3 成骨诱导分化实验
hESC经成骨培养基诱导后，细胞形态发生明显改变。2w后做碱性磷酸酶染色，镜下观察，胞质中呈现灰黑色沉淀；3w后做细胞茜素红S染色，镜下可见细胞浆中出现大量深红色化合物，钙结节被染成红色（图4）。
4 讨论
人胚胎干细胞（hESCs），能够自我更新和多向分化的生物学特性， 能诱导分化为多个胚层的细胞具有重要的医学价值，在基因治疗、组织工程学、药学研究等许多领域都具有广泛的应用。利用培育的干细胞来实现组织再生和器官修复对于许多重大疾病如老年性痴呆、糖尿病、帕金森病、心脏疾病、神经损伤等的治疗具有重要意义，同时也是新药研发的重要工具。
很多学者在体外扩增间充质干细胞，并在三维培养皿中进行培养和诱导分化[3]，同时也有利用微载体和生物反应器系统进行种子细胞的扩增[4，5]。但是有研究指出，利用动态培养系统对间充质干细胞进行工程化骨组织构建，优于静态培养和诱导体系，并有利于提高干细胞成骨分化的分化率，碱性磷酸酶活性、胞外钙基质沉积和骨桥蛋白分泌等[6]。
器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的，是一个非常复杂的三维过程。 hESC在体外发育成一完整的器官 ，像肝、心、肺等大型精细复杂的器官这一目标需要很大技术上的突破。目前要离体培养并维持其组织器官正常的生理功能目前还无法做到，器官的体外保存和维持更是器官移植的巨大难题。本实验体外培养的hESC表达人早期胚胎阶段特异性抗原；表达与多能性有关的关键蛋白如oct4；体外长期培养可以维持干细胞的多能性特征和正常的核型特征，证明我们建立的消化、传代、培养体系可以很好地满足hESC的生长需要。
hESC最快可能应用于临床的层次是细胞替代治疗，这需要组织工程学的配合。本实验在hESC培养基中添加成骨诱导剂，体外诱导培养2周，碱性磷酸酶染色阳性；接着让其继续诱导培养至第3周时，茜素红染色时可见明显钙结节形成，证明本实验方法可以促使干细胞能向成骨细胞分化，这為后续研究组织修复及再生提供很好的基础。
参考文献：
[1] Thomson JA， Itskovitz-Eldor J， Shapiro SS， Waknitz MA， Swiergiel JJ， et al. （1998） Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282： 1145-1147.
[2] Lim UM， Sidhu KS， Tuch BE （2006） Derivation of Motor Neurons from three Clonal Human Embryonic Stem Cell Lines. Curr Neurovasc Res 3： 281-288.
[3] Banf A，Bianchi G Notaro R et al （2002） Replicative aging and gene expression in long·term cultures ofhuman bone marrow stromal cells. Tissue Eng，8（6）：901-91 0
[4] Sun L Y Hsieh D K，Syu W S，et al （2010） Cell proliferation of human bone marow mesenchymal stem cells on biodegradable microcarriers enhances in vitro diferentiation potential[J] Cell Prolif，43（5）：445-456.
[5] FAN Xiu·bo，SONG Ke-dong，LIU Tian-qing，et al （2010） Simultaneous expansion and harvest of hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood [J].JChemEng ofChineseUniv，24（5）：808-81 8
[6] Holtorf H L，Jansen J A，Mikos A G （2005） Flow perfusion culture induces the osteoblastic diferentiation of marrow stromal cell—scafold constructs in the absence of dexamethasone J1_J Biomed Mater Res Part A， 72（3）：326-334