【摘 要】
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目的 观察CRISPR/Cas9技术在组蛋白去甲基化酶Kdm2b基因大片段敲除小鼠模型构建中的应用效果.方法 首先,在Kdm2b基因第7个外显子的5\'端和第9个外显子的3\'端各设计两个向导RNA(sgRNA),分别插入PX459载体构建重组质粒;将四种sgRNA的重组质粒两两组合(sgRNA3-1和sgRNA5-1、sgRNA3-1和sgRAN5-2、sgRNA3-2和sgRNA5-1、sgRNA3-2和sgRAN5-2),然后转染入小鼠NIH3T3细胞,筛选出sgRNA3-2和sgRAN5-
【机 构】
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福建省妇幼保健院 福建医科大学附属医院生殖医学中心,福州350001
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目的 观察CRISPR/Cas9技术在组蛋白去甲基化酶Kdm2b基因大片段敲除小鼠模型构建中的应用效果.方法 首先,在Kdm2b基因第7个外显子的5\'端和第9个外显子的3\'端各设计两个向导RNA(sgRNA),分别插入PX459载体构建重组质粒;将四种sgRNA的重组质粒两两组合(sgRNA3-1和sgRNA5-1、sgRNA3-1和sgRAN5-2、sgRNA3-2和sgRNA5-1、sgRNA3-2和sgRAN5-2),然后转染入小鼠NIH3T3细胞,筛选出sgRNA3-2和sgRAN5-2为Kdm2b基因敲除的最佳组合.对3～6周龄C57BL/6母鼠进行诱导排卵,使之与公鼠交配,授精成功后处死母鼠,取出受精卵,放入培养液中培养.最后,利用细胞质显微注射技术在小鼠原核期胚胎中注射sgRNA3-2、sgRAN5-2和Cas9的mRNA,将存活的胚胎移植到假孕母鼠输卵管壶腹部.待小鼠出生1周左右,剪取尾尖,用酚/氯仿法抽提尾尖中的基因组DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳及基因测序;纯合子小鼠在出生4周后,观察其表型.结果 最终获得13只小鼠.经过基因鉴定,Kdm2b基因大片段缺失的纯合子小鼠1只,杂合子小鼠3只,另外9只Kdm2b基因未见改变;纯合子小鼠鼠尾组织中Kdm2b基因中的外显子7至外显子9基因序列缺失.纯合子小鼠在初生4周后,出现卷尾.结论 应用CRISPR/Cas9技术成功构建了去甲基化酶Kdm2b基因大片段敲除的小鼠模型.
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