探讨泛素特异性肽酶10(USP10)在胰腺癌吉西他滨耐药中的作用及机制。

采用实验研究方法。(1)CCK8检测胰腺癌细胞系BxPC－3、PANC－1及SW1990中USP10的半抑制浓度(IC₅₀)值。(2)Western blot检测胰腺癌细胞系BxPC－3、PANC－1、SW1990、SW1990－GEM中USP10蛋白表达水平。(3)细胞分组：将SW1990细胞进行siRNA干扰，转染对照siRNA设为对照组，转染USP10siRNA设为USP10干扰组。(4)CCK8检测对照组和USP10干扰组胰腺癌细胞中吉西他滨的IC₅₀值。(5)克隆形成实验：计数对照组和USP10干扰组胰腺癌细胞形成的细胞克隆数，并计算克隆形成率。(6)流式细胞仪检测细胞凋亡：采用0.30 μg/mL吉西他滨分别干预对照组和USP10干预组细胞48 h。计算凋亡细胞百分比。(7)流式细胞仪检测细胞周期：采用0.3 μg/mL吉西他滨分别干预对照组和USP10干预组细胞48 h，流式细胞仪检测细胞周期。(8)Western blot检测细胞相关蛋白的表达：①采用浓度为0、0.30、0.60、1.20 μg/mL的吉西他滨分别干预对照组和USP10干预组细胞72 h。检测不同浓度下两组细胞中USP10和P21蛋白表达水平。②采用浓度为0.30 μg/mL的吉西他滨分别干预对照组和USP10干预组细胞0、24、48、72 h。检测不同时间点两组细胞中USP10和P21蛋白表达水平。③检测SW1990、SW1990－GEM细胞中P53蛋白表达水平。④采用浓度为0、0.30、0.60、1.20 μg/mL的吉西他滨干预SW1990细胞72 h。检测不同浓度下SW1990细胞中P53蛋白表达水平。⑤采用浓度为0.30 μg/mL的吉西他滨分别干预SW1990细胞0、24、48、72 h。检测不同时间点SW1990细胞中P53蛋白表达水平。(9)免疫共沉淀法检测蛋白之间相互作用。计量资料以

±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验。两组比较采用t检验。

(1)不同胰腺癌细胞系吉西他滨IC₅₀值和USP10表达水平：①CCK8检测BxPC－3、PANC－1、SW1990胰腺癌细胞采用吉西他滨处理72 h的IC₅₀值分别为(0.070±0.040)μg、(0.120±0.010)μg和(0.350±0.050)μg，3者比较，差异有统计学意义(F＝10.765，P<0.05)。SW1990细胞分别与BxPC－3和PANC－1细胞比较，差异均有统计学意义(t＝－7.122，－7.011，P<0.05)；BxPC－3和PANC－1细胞比较，差异有统计学意义(t＝3.510，P<0.05)。②Western blot方法检测BxPC－3、PANC－1、SW1990胰腺癌细胞中USP10蛋白相对表达量分别为2.280±0.090、1.930±0.030、0.950±0.010，3种细胞系比较，差异有统计学意义(F＝12.120，P<0.05)。SW1990细胞分别与BxPC－3和PANC－1细胞比较，差异均有统计学意义(t＝14.305，20.455，P<0.05)，BxPC－3和PANC－1细胞比较，差异有统计学意义(t＝7.501，P<0.05)。SW1990及SW1990－GEM胰腺癌细胞中USP10蛋白相对表达量分别为0.905±0.005、0.350±0.010，两种细胞系比较，差异有统计学意义(t＝12.300，P<0.05)。(2)CCK8检测对照组和USP10干扰组胰腺癌细胞采用吉西他滨处理72 h的IC₅₀值分别为(0.410±0.040)μg、(0.950±0.070)μg，两组比较，差异有统计学意义(t＝54.792，P<0.05)。(3)克隆形成实验结果显示：对照组和USP10干扰组胰腺癌细胞形成的细胞克隆数分别为(1 200±84)个和(2 300±105)个，两组比较，差异有统计学意义(t＝28.977，P<0.05)。克隆形成率分别为24%±3%和46%±5%，两组比较，差异有统计学意义(t＝10.200，P<0.05)。(4)流式细胞仪检测对照组和USP10干扰组胰腺癌细胞的细胞凋亡率分别为21%±4%、53%±3%，两组比较，差异有统计学意义(t＝7.133，P<0.05)。(5)流式细胞仪检测对照组和USP10干扰组胰腺癌细胞的G0/G1期细胞比例分别为69%±5%和46%±4%，S期分别为21%±3%和48%±3%，G2/M期细胞比例分别为9%±4%和11%±3%，两组上述指标比较，差异均有统计学意义(t＝9.392，11.308，7.152，P<0.05)。(6)Western blot检测胰腺癌细胞耐药机制相关蛋白的表达：①在0、0.30、0.60、1.20 μg/mL吉西他滨处理下，Western blot检测对照组胰腺癌细胞中USP10和P21蛋白表达量随药物浓度增加而增加，分别为0.960±0.050～2.205±0.150和0.840±0.010～2.505±0.150，具有浓度依赖性(F＝10.108，23.650，P<0.05)；USP10干扰组胰腺癌细胞中USP10和P21蛋白表达量不随药物浓度增加而变化，分别为0.120±0.010～0.905±0.050和0.520±0.010～0.435±0.010，不具有浓度依赖性(F＝4.288，16.807，P>0.05)。而P21表达基础值USP10干扰组也明显低于对照组，差异有统计学意义(t＝3.765，P<0.05)。②采用0.3 μg/mL吉西他滨分别干预0、24、48、72 h后，Western blot检测对照组胰腺癌细胞中USP10和P21蛋白表达量随干预时间增加而增加，分别为0.840±0.050～2.120±0.050和0.130±0.010～2.605±0.030，具有时间依赖性(F＝9.754，16.431，P<0.05)；USP10干扰组胰腺癌细胞中USP10和P21蛋白表达量不随干预时间增加而变化，分别为0.210±0.010～0.575±0.010和0.120±0.010～0.330±0.010，不具有时间依赖性(F＝8.390，12.756，P>0.05)。③Western blot检测胰腺癌细胞系SW1990及SW1990－GEM中P53蛋白的相对表达量分别为2.650±0.050和1.450±0.060，两者比较，差异有统计学意义(t＝19.075，P<0.05)。对照组和USP10干扰组胰腺癌细胞中P53蛋白的相对表达量分别为3.250±0.050和1.550±0.050，两组比较，差异有统计学意义(t＝9.240，P<0.05)。④在0、0.30、0.60、1.20 μg/mL吉西他滨干预72 h，Western blot检测SW1990胰腺癌细胞中P53蛋白相对表达量分别为0.590±0.050、1.015±0.050、2.050±0.050、2.850±0.050，呈现浓度依赖性(F＝34.088，P<0.05)。⑤采用0.3 μg/mL吉西他滨分别干预0、24、48、72 h后，Western blot检测SW1990胰腺癌细胞中P53蛋白相对表达量分别为0.890±0.050、1.225±0.030、2.180±0.150、3.030±0.150，呈现时间依赖性(F＝29.650，P<0.05)。(7)免疫共沉淀实验结果显示： SW－1990细胞蛋白中，P53蛋白复合物中存在USP10蛋白的表达；USP10蛋白复合物中存在大量P53蛋白表达。

胰腺癌中去泛素化酶USP10可能通过P53依赖途径参与了P21聚集诱发的吉西他滨原发及获得性耐药。