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[摘 要]目的：通过比较软胶囊中维生素D3的两种不同处理方法，为维生素D3的样品处理方法提供参考，从而建立一种快速、准确、简单的样品处理方法。方法：采用安捷伦Poroshell EC-C18色谱柱，流动相为甲醇-水（97：3），流速为 0.7ml/min，柱温为40℃，检测波长为264nm。结果：维生素D3在0.3130728μg/ml至2.348046μg/ml范围内呈良好的线性关系， 回归方程為Y=3.28×104X-7.24，相关系数为0.9999517，两种处理方法所得出的含量相差较小。结论：通过两种处理方法的结果对比及方法2的方法学验证，证明两种处理方法均科学有效。方法2更为快捷简单，溶剂使用量少，能够节省检验成本，适合企业使用。
[关键词]高效液相色谱法；维生素D3；结果对比；方法学验证
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）20-0295-02
维生素是各种生物维持正常生理功能所必需的一类低分子有机化合物。近年来，随着多种复合维生素保健品的广泛应用，建立对这些维生素的简单、快速、准确的处理方法是非常必要的[1]。大量文献报道[1-12]，高效液相色谱法是目前使用最普遍的测定维生素类的方法，应用广泛。维生素D是一种脂溶性维生素，主要作用是调节人体内钙和磷的代谢，促进其吸收利用，促进骨骼成长。当维生素D缺乏时，人体吸收钙、磷的能力下降，成骨作用受阻，甚至发生骨盐再溶解，形成儿童佝偻病或成人骨软化症[2]。维生素D遇光、氧气、热等易变质，处理过程可能导致目标物损失， 甚至可能检测不出。故开发一种快速、准确、简单的样品处理方法就显得非常必要。
研究部分
1.仪器、对照品与试剂
EQ-500超声波清洗器； Waters UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪；XP-205型电子分析天平；AL-204型电子分析天平；EMS-50型磁力搅拌水浴锅；R-202旋转蒸发器。
维生素D3对照品（来源：DR；批号：11019，纯度：99.7%）；正己烷（AR）；95%乙醇（AR）；石油醚（Ⅰ）（AR）；氢氧化钾（AR）；抗坏血酸（AR）；甲醇（HPLC）；一级用水。
2.两种处理方法的结果对比
2.1 色谱条件
Agilent Poroshell EC-C18色谱柱（2.7μm，100mm×4.6mm）；流动相为甲醇-水（97：3）；流速为 0.7ml/min；柱温为40℃；检测波长为264nm；进样量为8μl。
2.2 对照品储备液的配制
精密称取维生素D3对照品1.95mg至500ml容量瓶，加95%乙醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
2.3 对照品储备液的浓度校正
以95%乙醇为空白，在264nm波长处测定其吸光度，平均吸光度为0.1808，校正浓度为3.91341μg/ml（校正浓度（μg/ml）=平均吸光度/462×10000，462为维生素D3 1%比吸光系数）。
2.4 对照品工作液的配制
精密吸取2ml、3ml、5ml、10ml、15ml对照品储备液于25ml容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，摇匀。浓度为0.3130728μg/ml、0.4696092μg/ml、0.782682μg/ml、1.565364μg/ml、2.348046μg/ml。
2.5 处理方法
2.5.1 样品处理
称样：选择连续的3个样品批次，精确称取试样约0.5g，置于250ml锥形瓶中，用50ml 50℃的水使其分散均匀。（同时精密量取维生素D3对照品储备液2ml，做加标回收试验，加标量为7.82682μg）。
皂化：于上述处理的试样溶液中加入100ml维生素C的乙醇溶液（1.5%）、30ml氢氧化钾溶液（500g/400ml），盖上瓶塞。放在磁力搅拌水浴锅上（温度控制在53℃±2℃），磁力搅拌皂化45min，取出立刻冷却到室温。
提取：用少量的水将皂化液全部转入500ml分液漏斗中，加入100ml石油醚（Ⅰ），轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡10min后静置分层，将水相转入另一500ml分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入圆底烧瓶中。
浓缩：于旋转蒸发器上在40℃±2℃充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）。残渣精密加入10ml 95%乙醇，超声波提取溶解，过滤，即得。
2.5.2 测定法
分别精密吸取对照品工作液与供试品溶液各8μl，注入液相色谱仪，测定。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，在浓度为0.3130728μg/ml至2.348046μg/ml范围内，维生素D3的线性回归方程为Y=3.28×104X-7.24，相关系数为0.9999517，线性关系良好。
2.5.3 法率上胶溶解、磷的能力下降，成骨作用受阻，甚至发生骨盐再溶解，测定结果
通过计算，方法1的回收率为90.59%，扣除回收率后的样品含量为：
2.6 处理方法
2.6.1 样品处理
精密称取试样约0.5g，置于50ml离心管中，精密加入无水乙醇-正己烷=（9：1）溶液10ml，拧紧管塞，于超声波清洗器中60℃超声提取30分钟，并不时振摇，冷却至室温，离心，过滤，即得。
2.6.2 测定结果
通过计算，方法2的回收率为96.74%，扣除回收率后的样品含量为：
2.7 两种处理方法的结果对比：
表3 结果对比 3.处理方法2的方法学验证
3.1 线性关系试验
精密称取维生素D3对照品1.95mg至500ml容量瓶，加95%乙醇超声溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取2ml、3ml、5ml、10ml、15ml对照品储备液于25ml容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。浓度为0.3130728μg/ml、0.4696092μg/ml、0.782682μg/ml、1.565364μg/ml、2.348046μg/ml。分别精密吸取对照品工作液8μl，注入液相色谱仪，测定。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，维生素D3的线性回归方程为Y=3.28×104X-7.24，相关系数为0.9999517。结果表明在浓度为0.3130728μg/ml至2.348046μg/ml范围内呈良好的线性关系。
3.2 精密度试验
取对照品工作液，按上述色谱条件连续进样5次，测得维生素D3峰面积的RSD为0.3%。
3.3 稳定性试验
取对照品溶液分别于0，2，4，8，12，18h进行测定，维生素D3峰面积的RSD为0.7%，表明在18h内稳定。
3.4 重复性试验
取批号为20140701e的样品共6份，按方法2的供试品溶液的方法处理，依法测定，测得平均含量为1.239 mg/100g，RSD为1.6%。
3.5 加标回收试验
精密称取0.5g样品共9份，分成3组，每组3份。第一组精密加入1.6ml对照品储备液，第二组精密加入2.0ml对照品储备液，第三组精密加入2.4ml对照品储备液。按方法2的供试品溶液的方法处理，依法测定，结果如下：
平均回收率为96.1%，RSD为1.0%（n=9）。
4. 结论
方法1为国家标准 GB 5413.9-2010所使用的方法，方法2为优化后的处理方法。通过两种处理方法的结果对比及方法2的方法学验证，证明两种测定方法均科学有效。而且两种方法得出的含量均在规定范围之内（0.825～1.650 mg/100g），含量相差小，能对汤臣倍健维生素A维生素D软胶囊（儿童型）中维生素D3的含量起到质量控制的目的。而方法2的样品处理方法更为快捷简单，耗用时间短，溶剂使用量少，能够节省检验成本，提高人员利用率，更适合本企业使用。
5.讨论
（1）经过紫外光谱扫描，维生素D3在264nm波长处有最大吸收，因此选择264nm作为检测波长；
（2）流动相中甲醇与水的比例经过试验，当比例为（97：3）时样品中维生素D3与其他物质的分离度较好，且维生素D3的保留时间适中；
（3）在方法1中，当使用石油醚（Ⅰ）进行萃取后静置，有部分样品会出现乳化现象。当出现该现象时，往分液漏斗中加入适量纯化水或者95%乙醇，即可消除该现象；
（4）经过试验，方法2的样品在超声提取结束之后，置于冰箱，在-18℃冷冻30分钟再进行离心，过滤，色谱图中的杂质峰明显变少。
参考文献
[1]宋金春，李韵秋，曾俊芬.HPLC法测定注射用12种复合维生素中维生素D2、维生素A与维生素E的含量[J].中国药房，2007，18（31）：2456-2457.
[2]许强，刘金生，王轶鹏，张志涛，孙晓萌.反相高效液相色谱法测定维生素D2和维生素D3[J].理化检验-化学手册，2011，47（10）：1168-1172.
[3]曹晶萍，陈海波，高颖.高效液相色谱法同时测定人血清中维生素A、D3、E的含量[J].中国医院药学杂志，2008，28（10）：804-806.
[4]张明晶，关士海.保健食品中维生素D3测定方法的改进[J].中国医药指南，2012，10（31）：102-103.
[5]李青.维生素D3测定方法的比较[J].兽药与饲料添加剂，2002，7（6）：21-22.
[6]胡鑫鹦，盛翠凤.两种方法测定维生素D3含量[J].科技创新导报，2008，31：197-197.
[7]张学农，周慧，苗爱东，王萍，王新玲.正相高效液相测法定碳酸钙颗粒剂中微量维生素D3含量[J].新疆医科大学学报，2002，25（1）：39-41.
[8]黄敏，黄增琼.高效液相色谱法测定复合鱼肝油制剂中维生素A的含量[J].广西医科大学学报，2007，24（3）：600-601.
[9]钱玲慧，廖佳宇，李亚妮，莫晓帆，马丽，姚彤炜.测定维生素A的三种方法比较[J].实验技术与管理，2012，29（5）：43-48.
[10]刘红河，尹江伟，仲岳桐.HPLC-DAD同时测定食品中维生素A、D、E研究[J].中国卫生检验杂志，2005，（09）：1047-1049.
[11]王喬飞.HPLC法测定多维片中痕量维生素D3的含量[J].淮阴工学院学报，2010，19（3）：83-84.
[12]李东文.HPLC检测复合鱼肝油制剂中维生素A含量的可行行性[J].河北医药，2013，35（12）：1986-1987.
作者简介
黄成安（1985-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。
[关键词]高效液相色谱法；维生素D3；结果对比；方法学验证
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）20-0295-02
维生素是各种生物维持正常生理功能所必需的一类低分子有机化合物。近年来，随着多种复合维生素保健品的广泛应用，建立对这些维生素的简单、快速、准确的处理方法是非常必要的[1]。大量文献报道[1-12]，高效液相色谱法是目前使用最普遍的测定维生素类的方法，应用广泛。维生素D是一种脂溶性维生素，主要作用是调节人体内钙和磷的代谢，促进其吸收利用，促进骨骼成长。当维生素D缺乏时，人体吸收钙、磷的能力下降，成骨作用受阻，甚至发生骨盐再溶解，形成儿童佝偻病或成人骨软化症[2]。维生素D遇光、氧气、热等易变质，处理过程可能导致目标物损失， 甚至可能检测不出。故开发一种快速、准确、简单的样品处理方法就显得非常必要。
研究部分
1.仪器、对照品与试剂
EQ-500超声波清洗器； Waters UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪；XP-205型电子分析天平；AL-204型电子分析天平；EMS-50型磁力搅拌水浴锅；R-202旋转蒸发器。
维生素D3对照品（来源：DR；批号：11019，纯度：99.7%）；正己烷（AR）；95%乙醇（AR）；石油醚（Ⅰ）（AR）；氢氧化钾（AR）；抗坏血酸（AR）；甲醇（HPLC）；一级用水。
2.两种处理方法的结果对比
2.1 色谱条件
Agilent Poroshell EC-C18色谱柱（2.7μm，100mm×4.6mm）；流动相为甲醇-水（97：3）；流速为 0.7ml/min；柱温为40℃；检测波长为264nm；进样量为8μl。
2.2 对照品储备液的配制
精密称取维生素D3对照品1.95mg至500ml容量瓶，加95%乙醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
2.3 对照品储备液的浓度校正
以95%乙醇为空白，在264nm波长处测定其吸光度，平均吸光度为0.1808，校正浓度为3.91341μg/ml（校正浓度（μg/ml）=平均吸光度/462×10000，462为维生素D3 1%比吸光系数）。
2.4 对照品工作液的配制
精密吸取2ml、3ml、5ml、10ml、15ml对照品储备液于25ml容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，摇匀。浓度为0.3130728μg/ml、0.4696092μg/ml、0.782682μg/ml、1.565364μg/ml、2.348046μg/ml。
2.5 处理方法
2.5.1 样品处理
称样：选择连续的3个样品批次，精确称取试样约0.5g，置于250ml锥形瓶中，用50ml 50℃的水使其分散均匀。（同时精密量取维生素D3对照品储备液2ml，做加标回收试验，加标量为7.82682μg）。
皂化：于上述处理的试样溶液中加入100ml维生素C的乙醇溶液（1.5%）、30ml氢氧化钾溶液（500g/400ml），盖上瓶塞。放在磁力搅拌水浴锅上（温度控制在53℃±2℃），磁力搅拌皂化45min，取出立刻冷却到室温。
提取：用少量的水将皂化液全部转入500ml分液漏斗中，加入100ml石油醚（Ⅰ），轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡10min后静置分层，将水相转入另一500ml分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入圆底烧瓶中。
浓缩：于旋转蒸发器上在40℃±2℃充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）。残渣精密加入10ml 95%乙醇，超声波提取溶解，过滤，即得。
2.5.2 测定法
分别精密吸取对照品工作液与供试品溶液各8μl，注入液相色谱仪，测定。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，在浓度为0.3130728μg/ml至2.348046μg/ml范围内，维生素D3的线性回归方程为Y=3.28×104X-7.24，相关系数为0.9999517，线性关系良好。
2.5.3 法率上胶溶解、磷的能力下降，成骨作用受阻，甚至发生骨盐再溶解，测定结果
通过计算，方法1的回收率为90.59%，扣除回收率后的样品含量为：
2.6 处理方法
2.6.1 样品处理
精密称取试样约0.5g，置于50ml离心管中，精密加入无水乙醇-正己烷=（9：1）溶液10ml，拧紧管塞，于超声波清洗器中60℃超声提取30分钟，并不时振摇，冷却至室温，离心，过滤，即得。
2.6.2 测定结果
通过计算，方法2的回收率为96.74%，扣除回收率后的样品含量为：
2.7 两种处理方法的结果对比：
表3 结果对比 3.处理方法2的方法学验证
3.1 线性关系试验
精密称取维生素D3对照品1.95mg至500ml容量瓶，加95%乙醇超声溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取2ml、3ml、5ml、10ml、15ml对照品储备液于25ml容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。浓度为0.3130728μg/ml、0.4696092μg/ml、0.782682μg/ml、1.565364μg/ml、2.348046μg/ml。分别精密吸取对照品工作液8μl，注入液相色谱仪，测定。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，维生素D3的线性回归方程为Y=3.28×104X-7.24，相关系数为0.9999517。结果表明在浓度为0.3130728μg/ml至2.348046μg/ml范围内呈良好的线性关系。
3.2 精密度试验
取对照品工作液，按上述色谱条件连续进样5次，测得维生素D3峰面积的RSD为0.3%。
3.3 稳定性试验
取对照品溶液分别于0，2，4，8，12，18h进行测定，维生素D3峰面积的RSD为0.7%，表明在18h内稳定。
3.4 重复性试验
取批号为20140701e的样品共6份，按方法2的供试品溶液的方法处理，依法测定，测得平均含量为1.239 mg/100g，RSD为1.6%。
3.5 加标回收试验
精密称取0.5g样品共9份，分成3组，每组3份。第一组精密加入1.6ml对照品储备液，第二组精密加入2.0ml对照品储备液，第三组精密加入2.4ml对照品储备液。按方法2的供试品溶液的方法处理，依法测定，结果如下：
平均回收率为96.1%，RSD为1.0%（n=9）。
4. 结论
方法1为国家标准 GB 5413.9-2010所使用的方法，方法2为优化后的处理方法。通过两种处理方法的结果对比及方法2的方法学验证，证明两种测定方法均科学有效。而且两种方法得出的含量均在规定范围之内（0.825～1.650 mg/100g），含量相差小，能对汤臣倍健维生素A维生素D软胶囊（儿童型）中维生素D3的含量起到质量控制的目的。而方法2的样品处理方法更为快捷简单，耗用时间短，溶剂使用量少，能够节省检验成本，提高人员利用率，更适合本企业使用。
5.讨论
（1）经过紫外光谱扫描，维生素D3在264nm波长处有最大吸收，因此选择264nm作为检测波长；
（2）流动相中甲醇与水的比例经过试验，当比例为（97：3）时样品中维生素D3与其他物质的分离度较好，且维生素D3的保留时间适中；
（3）在方法1中，当使用石油醚（Ⅰ）进行萃取后静置，有部分样品会出现乳化现象。当出现该现象时，往分液漏斗中加入适量纯化水或者95%乙醇，即可消除该现象；
（4）经过试验，方法2的样品在超声提取结束之后，置于冰箱，在-18℃冷冻30分钟再进行离心，过滤，色谱图中的杂质峰明显变少。
参考文献
[1]宋金春，李韵秋，曾俊芬.HPLC法测定注射用12种复合维生素中维生素D2、维生素A与维生素E的含量[J].中国药房，2007，18（31）：2456-2457.
[2]许强，刘金生，王轶鹏，张志涛，孙晓萌.反相高效液相色谱法测定维生素D2和维生素D3[J].理化检验-化学手册，2011，47（10）：1168-1172.
[3]曹晶萍，陈海波，高颖.高效液相色谱法同时测定人血清中维生素A、D3、E的含量[J].中国医院药学杂志，2008，28（10）：804-806.
[4]张明晶，关士海.保健食品中维生素D3测定方法的改进[J].中国医药指南，2012，10（31）：102-103.
[5]李青.维生素D3测定方法的比较[J].兽药与饲料添加剂，2002，7（6）：21-22.
[6]胡鑫鹦，盛翠凤.两种方法测定维生素D3含量[J].科技创新导报，2008，31：197-197.
[7]张学农，周慧，苗爱东，王萍，王新玲.正相高效液相测法定碳酸钙颗粒剂中微量维生素D3含量[J].新疆医科大学学报，2002，25（1）：39-41.
[8]黄敏，黄增琼.高效液相色谱法测定复合鱼肝油制剂中维生素A的含量[J].广西医科大学学报，2007，24（3）：600-601.
[9]钱玲慧，廖佳宇，李亚妮，莫晓帆，马丽，姚彤炜.测定维生素A的三种方法比较[J].实验技术与管理，2012，29（5）：43-48.
[10]刘红河，尹江伟，仲岳桐.HPLC-DAD同时测定食品中维生素A、D、E研究[J].中国卫生检验杂志，2005，（09）：1047-1049.
[11]王喬飞.HPLC法测定多维片中痕量维生素D3的含量[J].淮阴工学院学报，2010，19（3）：83-84.
[12]李东文.HPLC检测复合鱼肝油制剂中维生素A含量的可行行性[J].河北医药，2013，35（12）：1986-1987.
作者简介
黄成安（1985-），男，本科，技术员，主要从事保健食品功效成分检测。