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[摘要]目的探讨加重期和稳定期COPD患者在YKIA0水平方面的差异。方法采用ELISA法检测2013年1月～2014年12月在我所住院的COPD加重期（AECOPD）的患者60例，COPD稳定期的患者59例及我所体检中心正常患者（对照组）50例血清中YKL-40的表达水平。分析COPD患者血清中YKL-40水平与COPD发病危险因素的相关性。结果实验结果显示，在对照组、COPD组和AECOPD组血清中YKL-40水平比较中，差异有统计学意义（P<0.01），AECOPD组和COPD组血清中YKL-40水平比较显示，差异有统计学意义（P<0.01）；AECOPD组血清中YKL-40水平比COPD组血清中的YKL-40水平高，差异有统计学意义（P<0.01）。AECOPD组患者血清YKL-40含量与FEV1/FVC呈负相关（r=-0.605，P<0.001），与FEV1%呈负相关（相关系数r=-0.525，P=0.003）。COPD组患者血清YKL-40含量与FEV1/FVC呈负相关（r=-0.601，P<0.001），与FEVI%呈负相关（r=-0.466，P=0.009）。结论COPD患者患病不同时期体内YKL40水平不一，对于临床后续治疗和相关药物的使用具有指导意义，值得深入研究。
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸科较为常见的一类病种，亦称为慢阻肺，主要能造成肺部损伤，导致不完全可逆的换气障碍，影响患者自身健康的特征疾病。该疾病的发生和发展除了患者自身由于肺损伤而导致的进行性疾病变化之外，还与呼吸过程中气体有害颗粒造成的肺部炎症有关。近年来COPD于我国的发病率呈显著上升趋势，而该疾病对于全身系统影响较大，具有较高的致残率和死亡率。我国40岁以上的患病人群约8.2%。其死亡率在我国死亡率中排第三位，在农村地区死亡率高居首位。目前学术界公认的COPD的发生与被动吸烟、职业因素、生物燃料的燃烧、长期哮喘、营养吸收情况等因素都有关系。而对于那些非吸烟引发的COPD患者中，基因则对疾病的发生有重要作用。综上所述，COPD的发生是遗传因素和环境因素双重作用的结果。
近些年的研究发现，COPD的发生还与人软骨糖蛋白（YKL-40）这种炎症因子有关。目前对于YKL-40的具体生物学功能的研究还不是十分的明确，也许与细胞分化、增殖等有关，它还可以对抗细胞凋亡因子的作用刺激血管生成；还可以参与细胞外组织从塑，刺激纤维母细胞生成。所以推测YKL-40是一个参与COPD慢性炎症的炎症因子。本实验采用ELISA法检测COPD患者急性加重期和稳定期患者，对照组患者血清中的YKL-40的水平，进一步探讨COPD患者血清中YKL-40与病因和病程的关系。
1资料与方法
1.1一般资料
选取2013年1月-2014年12月在我所就诊的COPD稳定期患者59例，年龄46-75岁，平均（59.3±7.5）岁，其中男26例，女33例。急性加重期（AECOPD）的共选择60例病患，按性别分类：男31例，女29例，年龄45-72岁，平均（53.3±5.3）岁。对照组患者50例，其中男25例，女25例，年龄44-77岁，平均（59.5±7.4）岁。
1.2 COPD诊断标准
COPD组和AECOPD组患者均符合《COPD诊治指南》（2010年版）的诊断标准：（1）所有患者年龄均在40岁以上，且具有接触致病因素历史（包括吸烟、重度油烟、粉尘环境工作等）；（2）所有患者临床表征均包括气喘、咳嗽、浓痰或出现短时间的呼吸困难；（3）患者使用支气管扩张剂后FEV1/FVC在70%以下；（4）排除其他呼吸道疾病患者包括支气管哮喘、结核、支气管扩张等。
1.3试验方法
1.3.1酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中YKL-40水平的基本原理采用EHSA法中的双抗免疫夹心法测定血清样本中的YKL-40的浓度。将单克隆抗体YKL-40与生物素结核后，再与酶标板上抗生素蛋白链菌素进行载体结合，最后使用标准品与YKL-40结合。多克隆抗体YKL-40实验步骤与上述不同，该抗体先与YKL-40蛋白结合，最后与外加底物对硝基磷酸苯脂（TMB）与碱性磷酸酶发生反应，发生显色反应后，定量分析依照变色程度进行。
1.3.2检测步骤本次研究采用双抗一部夹心法ELISA检测，试剂盒来自北京中检维康技术有限公司。实验过程中严格按照说明书中流程进行，操作具体如下：（1）实验前，酶标板在紫外灯下照射2h，以增加实验过程中特异性吸附，减少非特异性吸附。（2）酶标板中设置标准品、样品及阴参孔，标准品孔应设置为添加不同浓度梯度的标准品，各50μL，标准品的浓度梯度为0、20、40、60、80、160ng/mL。（3）每孔加入50μL的样本稀释液（10μL待测血清+40μL小牛血清）；阴性对照孔加入50μL小牛血清。（4）在所有孔中再加入100μL的含有HRP标记的检测抗体，37℃温箱孵育60min。（5）弃去液体，用平板纸将残余的液体拍干，每孔加入200μL（TBST）洗涤液，放在洗板机上进行洗板5min，将TBST弃去，拍干，重复洗涤4次。（6）板中加入TMB底物，100μL/孔，在37℃孵育10min，避光。（7）加入浓度8md/L的HCL终止液，每孔50μL，迅速用酶标仪测定各孔的OD值。
1.4实验中注意事项
（1）采集血清样品的过程要避免发生溶血，血液离心后迅速采集上层透明血清，并放入冰箱保存备用。（2）加样时间应控制在30min内，避免产生漂移。（3）所有耗材使用前必须严格高压消毒，实验过程中应避免交叉污染。
1.5统计学方法
本次研究所有患者资料及研究数据均采用Exed2007版进行记录和归类，统计学方法采用SPSS19.0版本进行处理，计量资料采用方差分析检验，计数资料以x2检验，两组的线性关系用Pearson进行处理，P<0.05为差异有统计学意义。 2结果
2.1三组患者一般资料比较
三组患者在性别、年龄、体重指数、男女比例等方面比较差异无统计学意义（P>0.05），即三组患者具有可比性，见表1。
2.2三组患者血清中YKL-40水平比较
实验结果显示，对照组、COPD组和AECOPD组血清中YKL-40水平分别为（26.32±3.54）、（40.32±8.43）和（65.32±13.74）ng/mL，三组比较，差异有统计学意义（F=138.4，P<0.01），AECOPD组和COPD组血清中YKL-40水平比较，差异有统计学意义（P<0.01）；AECOPD组血清中YKL-40水平比COPD组血清中的YKL-40水平高，差异有统计学意义（P<0.01）。
2.3三组患者肺功能检测指标比较
比较三组患者的肺功能检测指标发现FEV1、FEV1/FVC、FEVI%差异有统计学意义（P<0.05）。而COPD组和AECOPD组患者上述指标与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。AECOPD组患者上述指标与COPD组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.4相关性分析
AECOPD组患者血清YKL--40含量与FEV1/FVC呈负相关（r=-0.605，P<0.001），与FEV1%呈负相关（相关系数r=-0.525，P=0.003）。COPD组患者血清YKL-40含量与FEV1/FVC呈负相关（r=-0.601，P<0.001），与FEV1%呈负相关（r=-0.466，P=0.009）。
3讨论
COPD是可以预防治疗的一种疾病，主要特点是不完全可逆性气流受限，并伴有显著的肺外效应，是呈进行性发展的气流受限，主要成因是由肺部有害的气体和颗粒引发的炎症异常反应。COPD的发病目前主要认为是与炎症产生有关。在COPD炎症过程中起主要作用的是巨噬细胞，它分泌的一些炎症因子通过促进中性粒细胞聚集而引发炎症发生。这些细胞因子有IL-8、蛋白分解酶及中性粒细胞趋化因子等。我们在本实验讨论的YKL-40是巨噬细胞分泌的一种新型炎症因子。
多年来，对于YKL-40的研究已深入到与各类疾病的相关性当中，本次研究探讨COPD与YKL-40的关系后发现，该物质可能与疾病的炎症过程的发生和起到重塑等有关。本次实验通过检测不同进程的COPD患者血清中YKL-40表达量，探讨YKL-40在临床中的意义。
3.1YKL-40的生物学特性
YKL-40是一种较为特殊的几丁质酶蛋白，多存在于哺乳类动物中，医学又将其命名为人体软骨糖蛋白39，缩写YKL主要是以序列中起始的3个氨基酸（Tyrosine（Y）、Lysine（K）、Leucine（L））进行命名。该蛋白包含有383个氨基酸，主要是由几丁质酶-3样蛋白-1基因编码的长肽蛋白物质。该物质在免疫反应中发挥效益主要是通过键合方式。而且科学研究表明，在正常人体生理水平中存在的YKL-40的主要作用是防止炎症反应的发生。在人体正常基因组中，存在调控YKL-40表达的基因，而且在胚胎层中发现编码YKL-40的mRNA蛋白的表达。当机体发生疾病时，YKL-40会出现过度表达的现象，这种情况可能发生在分子、细胞及组织水平中。而目前局限于技术等层面，对于YKL-40的生物学功能和在人体内的相关作用尚未有完整的解释，但推测其可能与细胞增殖、组织重构、对抗细胞凋亡等有关。
3.2 YKL-40与COPD@关系
有报道显示，YKL-40参与COPD疾病发生和发展的各个过程中，该物质与COPD进行性发展致使全身性的炎症反应有关。Severine Letuve等的试验表明，COPD患者血清中的YKL-40含量显著高于正常患者，同时对患者肺泡、支气管活检组织以及肺泡巨噬细胞中的YKL-40进行检测，均表明患者高于正常人群，且差异有统计学意义。
本次实验结果显示，在YKL-40于血清中的含量比较时，对照组、COPD组和AECOPD组等三组差异有统计学意义（P<0.01），AECOPD组和COPD组血清中YKL-40水平比较显示，差异有统计学意义（P<0.01）；AECOPD组血清中YKL-40水平比COPD组血清中的YKL-40水平高，差异有统计学意义（P<0.01）。AECOPD组患者血清YKL-40含量与FEV1/FVC呈负相关（r=-0.605，P<0.001），与FEVI%呈负相关（相关系数r=-0.525，P=0.003）。COPD组患者血清YKL-40含量与FEV1/FVC呈负相关（r=-0.601，P<0.01），与FEV1%呈负相关（r=-0.466，P=0.009）。
综上所述，COPD患者患病不同时期体内YKL40水平不一，对于临床后续治疗和相关药物的使用具有指导意义，值得深入研究。
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸科较为常见的一类病种，亦称为慢阻肺，主要能造成肺部损伤，导致不完全可逆的换气障碍，影响患者自身健康的特征疾病。该疾病的发生和发展除了患者自身由于肺损伤而导致的进行性疾病变化之外，还与呼吸过程中气体有害颗粒造成的肺部炎症有关。近年来COPD于我国的发病率呈显著上升趋势，而该疾病对于全身系统影响较大，具有较高的致残率和死亡率。我国40岁以上的患病人群约8.2%。其死亡率在我国死亡率中排第三位，在农村地区死亡率高居首位。目前学术界公认的COPD的发生与被动吸烟、职业因素、生物燃料的燃烧、长期哮喘、营养吸收情况等因素都有关系。而对于那些非吸烟引发的COPD患者中，基因则对疾病的发生有重要作用。综上所述，COPD的发生是遗传因素和环境因素双重作用的结果。
近些年的研究发现，COPD的发生还与人软骨糖蛋白（YKL-40）这种炎症因子有关。目前对于YKL-40的具体生物学功能的研究还不是十分的明确，也许与细胞分化、增殖等有关，它还可以对抗细胞凋亡因子的作用刺激血管生成；还可以参与细胞外组织从塑，刺激纤维母细胞生成。所以推测YKL-40是一个参与COPD慢性炎症的炎症因子。本实验采用ELISA法检测COPD患者急性加重期和稳定期患者，对照组患者血清中的YKL-40的水平，进一步探讨COPD患者血清中YKL-40与病因和病程的关系。
1资料与方法
1.1一般资料
选取2013年1月-2014年12月在我所就诊的COPD稳定期患者59例，年龄46-75岁，平均（59.3±7.5）岁，其中男26例，女33例。急性加重期（AECOPD）的共选择60例病患，按性别分类：男31例，女29例，年龄45-72岁，平均（53.3±5.3）岁。对照组患者50例，其中男25例，女25例，年龄44-77岁，平均（59.5±7.4）岁。
1.2 COPD诊断标准
COPD组和AECOPD组患者均符合《COPD诊治指南》（2010年版）的诊断标准：（1）所有患者年龄均在40岁以上，且具有接触致病因素历史（包括吸烟、重度油烟、粉尘环境工作等）；（2）所有患者临床表征均包括气喘、咳嗽、浓痰或出现短时间的呼吸困难；（3）患者使用支气管扩张剂后FEV1/FVC在70%以下；（4）排除其他呼吸道疾病患者包括支气管哮喘、结核、支气管扩张等。
1.3试验方法
1.3.1酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中YKL-40水平的基本原理采用EHSA法中的双抗免疫夹心法测定血清样本中的YKL-40的浓度。将单克隆抗体YKL-40与生物素结核后，再与酶标板上抗生素蛋白链菌素进行载体结合，最后使用标准品与YKL-40结合。多克隆抗体YKL-40实验步骤与上述不同，该抗体先与YKL-40蛋白结合，最后与外加底物对硝基磷酸苯脂（TMB）与碱性磷酸酶发生反应，发生显色反应后，定量分析依照变色程度进行。
1.3.2检测步骤本次研究采用双抗一部夹心法ELISA检测，试剂盒来自北京中检维康技术有限公司。实验过程中严格按照说明书中流程进行，操作具体如下：（1）实验前，酶标板在紫外灯下照射2h，以增加实验过程中特异性吸附，减少非特异性吸附。（2）酶标板中设置标准品、样品及阴参孔，标准品孔应设置为添加不同浓度梯度的标准品，各50μL，标准品的浓度梯度为0、20、40、60、80、160ng/mL。（3）每孔加入50μL的样本稀释液（10μL待测血清+40μL小牛血清）；阴性对照孔加入50μL小牛血清。（4）在所有孔中再加入100μL的含有HRP标记的检测抗体，37℃温箱孵育60min。（5）弃去液体，用平板纸将残余的液体拍干，每孔加入200μL（TBST）洗涤液，放在洗板机上进行洗板5min，将TBST弃去，拍干，重复洗涤4次。（6）板中加入TMB底物，100μL/孔，在37℃孵育10min，避光。（7）加入浓度8md/L的HCL终止液，每孔50μL，迅速用酶标仪测定各孔的OD值。
1.4实验中注意事项
（1）采集血清样品的过程要避免发生溶血，血液离心后迅速采集上层透明血清，并放入冰箱保存备用。（2）加样时间应控制在30min内，避免产生漂移。（3）所有耗材使用前必须严格高压消毒，实验过程中应避免交叉污染。
1.5统计学方法
本次研究所有患者资料及研究数据均采用Exed2007版进行记录和归类，统计学方法采用SPSS19.0版本进行处理，计量资料采用方差分析检验，计数资料以x2检验，两组的线性关系用Pearson进行处理，P<0.05为差异有统计学意义。 2结果
2.1三组患者一般资料比较
三组患者在性别、年龄、体重指数、男女比例等方面比较差异无统计学意义（P>0.05），即三组患者具有可比性，见表1。
2.2三组患者血清中YKL-40水平比较
实验结果显示，对照组、COPD组和AECOPD组血清中YKL-40水平分别为（26.32±3.54）、（40.32±8.43）和（65.32±13.74）ng/mL，三组比较，差异有统计学意义（F=138.4，P<0.01），AECOPD组和COPD组血清中YKL-40水平比较，差异有统计学意义（P<0.01）；AECOPD组血清中YKL-40水平比COPD组血清中的YKL-40水平高，差异有统计学意义（P<0.01）。
2.3三组患者肺功能检测指标比较
比较三组患者的肺功能检测指标发现FEV1、FEV1/FVC、FEVI%差异有统计学意义（P<0.05）。而COPD组和AECOPD组患者上述指标与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。AECOPD组患者上述指标与COPD组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.4相关性分析
AECOPD组患者血清YKL--40含量与FEV1/FVC呈负相关（r=-0.605，P<0.001），与FEV1%呈负相关（相关系数r=-0.525，P=0.003）。COPD组患者血清YKL-40含量与FEV1/FVC呈负相关（r=-0.601，P<0.001），与FEV1%呈负相关（r=-0.466，P=0.009）。
3讨论
COPD是可以预防治疗的一种疾病，主要特点是不完全可逆性气流受限，并伴有显著的肺外效应，是呈进行性发展的气流受限，主要成因是由肺部有害的气体和颗粒引发的炎症异常反应。COPD的发病目前主要认为是与炎症产生有关。在COPD炎症过程中起主要作用的是巨噬细胞，它分泌的一些炎症因子通过促进中性粒细胞聚集而引发炎症发生。这些细胞因子有IL-8、蛋白分解酶及中性粒细胞趋化因子等。我们在本实验讨论的YKL-40是巨噬细胞分泌的一种新型炎症因子。
多年来，对于YKL-40的研究已深入到与各类疾病的相关性当中，本次研究探讨COPD与YKL-40的关系后发现，该物质可能与疾病的炎症过程的发生和起到重塑等有关。本次实验通过检测不同进程的COPD患者血清中YKL-40表达量，探讨YKL-40在临床中的意义。
3.1YKL-40的生物学特性
YKL-40是一种较为特殊的几丁质酶蛋白，多存在于哺乳类动物中，医学又将其命名为人体软骨糖蛋白39，缩写YKL主要是以序列中起始的3个氨基酸（Tyrosine（Y）、Lysine（K）、Leucine（L））进行命名。该蛋白包含有383个氨基酸，主要是由几丁质酶-3样蛋白-1基因编码的长肽蛋白物质。该物质在免疫反应中发挥效益主要是通过键合方式。而且科学研究表明，在正常人体生理水平中存在的YKL-40的主要作用是防止炎症反应的发生。在人体正常基因组中，存在调控YKL-40表达的基因，而且在胚胎层中发现编码YKL-40的mRNA蛋白的表达。当机体发生疾病时，YKL-40会出现过度表达的现象，这种情况可能发生在分子、细胞及组织水平中。而目前局限于技术等层面，对于YKL-40的生物学功能和在人体内的相关作用尚未有完整的解释，但推测其可能与细胞增殖、组织重构、对抗细胞凋亡等有关。
3.2 YKL-40与COPD@关系
有报道显示，YKL-40参与COPD疾病发生和发展的各个过程中，该物质与COPD进行性发展致使全身性的炎症反应有关。Severine Letuve等的试验表明，COPD患者血清中的YKL-40含量显著高于正常患者，同时对患者肺泡、支气管活检组织以及肺泡巨噬细胞中的YKL-40进行检测，均表明患者高于正常人群，且差异有统计学意义。
本次实验结果显示，在YKL-40于血清中的含量比较时，对照组、COPD组和AECOPD组等三组差异有统计学意义（P<0.01），AECOPD组和COPD组血清中YKL-40水平比较显示，差异有统计学意义（P<0.01）；AECOPD组血清中YKL-40水平比COPD组血清中的YKL-40水平高，差异有统计学意义（P<0.01）。AECOPD组患者血清YKL-40含量与FEV1/FVC呈负相关（r=-0.605，P<0.001），与FEVI%呈负相关（相关系数r=-0.525，P=0.003）。COPD组患者血清YKL-40含量与FEV1/FVC呈负相关（r=-0.601，P<0.01），与FEV1%呈负相关（r=-0.466，P=0.009）。
综上所述，COPD患者患病不同时期体内YKL40水平不一，对于临床后续治疗和相关药物的使用具有指导意义，值得深入研究。