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摘 要：依托教师科研项目，以典型环境内分泌干扰物双酚A（Bisphenol A，BPA）为实验对象，基于高效液相色谱技术设计并开展创新实验，引导学生自主思考及实验探索，从分散液液微萃取前处理及高效液相色谱仪器分析两大方面，摸索并优化各项参数条件，建立高效、便捷的检测方法用于定量分析水样中BPA。创新实验设计结合了新颖的科研内容，激发学生主动探索的兴趣，不仅强化了学生的基本实验技能，而且培养和提升了学生的科研思维及综合运用知识的能力。
关键词：创新实验;实验教学;高效液相色谱
2016 年召开的全国科技创新大会提出，我国要在2030 年进入创新型国家前列，2050 年成为创新强国。实验室是高等学校实施素质教育、培养学生创新精神与实践能力的重要基地[1]，但常规的学生实验教学往往不能充分培养学生的创新能力。在当前国家大力推进大众创新创业的背景下，开设创新实验项目是高校培养学生协作能力、科研能力、创新能力以及综合素质的重要环节[2]。同时，教学和科研相辅相成，基于科研过程和科研成果的创新实验教学更有助于激发学生对知识的探索欲，加深学生对专业学科领域的认识，强化学生的创新意识，提升学生的创新思维[3]。促进科研与教学互动，把科研成果转化为实验教学内容，使实验教学从传统的“知识传授”转变为“知识、能力、思维、素质”综合素质培养，对推动大学生参与科学研究、营造良好的学术氛围、培养学生的创新精神具有深远意义，具有广阔的发展空间。
合适的实验项目是创新实验开展的重要基础，创新实验设计结合新颖的科研内容，教学内容尚未涉及，具有一定的前瞻性，能引起学生主动探索未知的兴趣，并有利于培养学生的创新能力和综合素质，实现学生 “高分高能”的培养目标[4]。
BPA在工业上常被用来合成环氧树脂和聚碳酸醋等材料，从塑料袋、塑料饭盒、矿泉水瓶等日常用品，到医疗器械、食品包装的内衬等，生活中到处都有BPA的身影。BPA的大量生产和使用使它不断转移至环境，且大量研究已证明即便在极低剂量（ng/L）的存在下，BPA也能干扰人体及动物正常的内分泌系统，从而影响生殖功能，导致恶性肿瘤的产生等一系列严重损害，甚至具有遗传效应[5]。然而，在对环境样品中痕量的 BPA 进行分析的过程中，往往由于BPA的浓度较低甚至是微量、基质组成复杂而被干扰，常规检测方法达不到检测要求。因此，高效、灵敏、便捷的检测方法是开展BPA环境行为研究的基础和保障，同时，环境样品中BPA有效分离和富集的前处理至关重要。
分散液液微萃取（Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）技术作为一种新型的样品前处理手段，自Rezaee 等人于 2006 年首次提出以来迅速成为研究热点[6]。Leong等在此基础上建立了上浮溶剂固化分散液液微萃取技术（DLLME-SFO），采取低密度有机萃取剂，并在萃取离心后结合冷冻固化使萃取相凝固以方便移取。DLLME-SFO进一步简化了操作，具有样品需求量小、有机溶剂用量少、操作简便、萃取时间短、环境友好等突出[7]。本创新实验结合分散液液微萃取上浮溶剂固化（DLLME-SFO）的样品前处理方法和高效液相色谱法（HPLC）定量分析技术的联用，指导学生全程参与实验的各个环节，设计并优化样品前处理及HPLC仪器分析的各项参数，建立快捷高效的水样BPA检测方法。教师全程指导，学生全程参与实验设计及开展，全方位培养学生的“知识、能力、思维、素质”。同时，注重培养学生掌握文献查阅和Word、Excel等文本编辑方法，以及SPSS、ORIGIN等数据统计分析软件的使用，学习科研论文的基本组成和撰写。
本创新实验的核心内容是从两个方面进行参数优化确定：其一是BPA定量分析的HPLC仪器检测条件;另一方面是样品的DLLME-SFO前处理条件。
基于环境介质的复杂性以及环境样品中BPA浓度通常较低的特点，通过样品前处理需要达到分离和富集的目的，将BPA从样品中分离出来并去除基体干扰，同时还要达到一定程度的富集效果以满足后续定量检测方法的检出浓度。在进行样品中BPA检测的DLLME-SFO前处理条件优化时，主要通过富集倍数（Extraction Factor，EF）和萃取回收率（Extraction Recovery，ER）两项指标进行萃取效果的考察和比較[8]，进而确定优化的萃取条件。
EF为上浮萃取相中BPA的浓度与水样中BPA浓度的比值，Cfloated为萃取所得上浮相中BPA的浓度，C0为水样中BPA的浓度。
萃取回收率ER（%）为萃取相中BPA的量占水样中BPA量的百分比例，Mfloated为上浮萃取相中BPA的质量，M0为水样中BPA的质量。Vfloated和V0分别为萃取相的体积和水样体积。
样品经过DLLME-SFO前处理，其中的BPA分离富集至萃取相，并经由离心冷冻后取出，所得到的萃取相融化后即可进一步结合检测仪器进行定量分析。与气相色谱（GC）和气相色谱/质谱（GC/MS）等相比，高效液相色谱（HPLC）具有操作方便、测定时间短等优势。在确定BPA检测的HPLC色谱条件时，需重点考察并确定流动相的种类及流量、检测波长、柱温、进样量等参数;并建立优化条件下BPA测定的标准曲线，用于BPA的定量分析。
最后，还需对实验所建立的DLLME-SFO-HPLC检测方法进行评价。采用逐步稀释法结合高效液相色谱工作站，确定方法的检出限和定量限。结合加标回收实验，分析加标回收率和相对标准偏差。从方法的线性范围、检出限、实际样品加标回收率等方面进行所建检测方法的综合评价。
在教师的引导下，学生需全程参与文献查阅、实验详细设计、实验开展及实验总结汇报的各个环节，整体设计见下图，将复杂的综合性实验分解为几个步骤逐步开展。教师主要指导实验的整体思路及技术要点，并及时解答学生的疑问，详细的实验方案及操作由学生具体开展。
首先查阅相关文献，对BPA、DLLME-SFO、HPLC等背景信息进行梳理。进一步细化实验方案，对BPA的HPLC检测条件进行确定，从流动相、检测波长、柱温、进样量等因素进行条件优化，并基于优化的仪器条件进行标准曲线的建立。
在HPLC检测条件确定的基础上，进一步开展DLLME-SFO样品前处理方法的条件优化。结合实验，对萃取剂和分散剂的类型及萃取时间进行初步筛选，利用全因子实验以萃取回收率和富集倍数为指标对DLLME-SFO过程的萃取剂用量和分散剂用量进一步确定，再结合单因素实验考察pH值、盐離子强度、超声辅助条件的优化确定。采取上一步实验所确定的HPLC条件，定量检测各实验所得萃取相中的BPA，并结合萃取回收率ER和富集倍数EF进行萃取效果的评价和优化萃取条件确定。
最后根据实验过程及实验记录，形成实验报告，并针对其中的要点和亮点以PPT形式进行汇报及交流。
本创新实验项目采取学生组建团队的模式申请参加，按“项目背景调研—问题分析—文献查阅—实验方案细化—实验开展—数据分析—汇报总结”的顺序开展，并以科研论文的规范要求提交实验报告。
4.1 实验准备
教师下达“实验任务书”，简要介绍本创新实验的研究背景，实验的整体思路，实验过程需重点关注的因素。要求学生充分开展资料查阅和交流讨论，了解BPA及其研究现状，理解DLLME-SFO前处理的基本原理，掌握高效液相色谱法的基本原理和HPLC仪器的基本操作。在此基础上，由学生自行拟订详细实验方案，内容包括方法综述、理论依据、研究内容、实验步骤、操作方案、可行性分析、注意事项及参考文献等，并经教师审阅。
4.2 实验过程：
采用“引导-设计-探索-交流-引导”的模式，指导学生逐步细化实验方案并分步推进。先后依次开展BPA 的 HPLC 检测条件确定及标准曲线建立，DLLME 萃取剂、 分散剂的选用及用量确定，萃取条件的参数优化确定，所建立 DLLME-HPLC 方法的评价及水样中 BPA 的测定。每部分实验分别由小组的一名同学主要负责，并做到全员参与。实验过程充分调动学生的主动性，充分发挥学生的自主思考能力，尽量按照自己的思路开展实验。教师仅提供技术指导和整体进度把控，且指导方式多样化。比如，本实验的开展过程需大量使用高效液相色谱仪，教师制作了“HPLC 的操作及应用” 等教学微视频，辅助指导学生进行仪器操作，取得了较好的效果。又如，在HPLC流动相的选择和确定方面，由学生自行查阅资料提出几种备选方案，与教师讨论交流后，筛选出几种最可行的方案，再由学生展开实验进一步结合实验结果进行优化确定。同时，在实验过程中特别强调认真进行实验原始数据的记录，以便及时发现问题解决问题，并及时与指导教师汇报交流。
4.3 实验总结：
学生在实验后进一步梳理实验过程与结果，对异常现象进行讨论或提出创造性建议，将实验过程中遇到的问题及实验结论的得出过程进行详细分析。在此基础上，以论文的形式对实验结果归纳、总结与讨论，最后以 PPT 形式汇报交流。
创新实验相较常规实验教学费时费力，但参与该实验的学生由被动参与者转变为实验路线的设计者和实验方案的制订者，学生积极思考、主动参与、相互探讨。实验过程有效激发学生的研究兴趣，充分发挥了学生的主动性和创造性。创新实验的开展，使学生对相关专业知识有了更深刻的理解，操作技能及合作精神得以强化，信息获得及利用的能力有所提高，创新思维及表达能力得到锻炼，视野进一步开阔，学习动力及学习方向更加明晰，为后续的学习及工作奠定了较好的基础。
参考文献：
[1]贾永霞. 创新性实验教学的探究与实践[J]. 实验室研究与探索， 2018， 37（12）：206-208.
[2]陈子辉， 王泽生. 基于创新实验项目的实验室开放机制研究[J]. 实验技术与管理， 2016， 33（1）：17-20.
[3]李旭， 张为公. 基于科研项目的数字电路创新型实验教学改革[J]. 实验室研究与探索， 2015， 34（1）：168-171.
[4]李从举. 以科研推动本科生的创新能力和综合素质的提高[J]. 实验室科学， 2011， 14（3）：1-4.
[5]杨清伟， 梅晓杏， 孙姣霞，等. 典型环境内分泌干扰物的来源、环境分布和主要环境过程[J]. 生态毒理学报， 2018， 13（3）：42-55.
[6]邓勃. 一种新的液液萃取模式-分散液液微萃取[J]. 现代科学仪器， 2010（3）：123-130.
[7]赵姗姗， 金炀， 王香，等. 分散液液微萃取应用的研究进展[J]. 中成药， 2020， 42（3）：180-185.
[8]马燕玲， 陈令新， 丁养军，等. 超声辅助分散液液微萃取——高效液相色谱测定水样中的4种邻苯二甲酸酯类增塑剂[J]. 色谱， 2013， 31（2）：155-161.
基金项目：本文系2019年重庆交通大学高等教育教学改革研究课题，项目名称：重庆交通大学高教所，综合设计性实验——水中双酚A的DLLME-HPLC检测方法建立及条件优化，项目编号：1903086;本文系2020年重庆市教育委员会科学技术研究项目，项目名称：重庆市教委，生物炭对消落带土壤吸附固定EDCs的影响研究，项目编号：KJQN202000743;本文系2021年重庆市中小学创新人才培养工程项目计划研究项目，重庆市教委，生物炭的制备及其对污染物的吸附性能，项目编号：CY210711。
作者简介：胡莺（1982— ），女，重庆人，博士，讲师，研究方向：新型污染物的环境行为及污染防控。
关键词：创新实验;实验教学;高效液相色谱
2016 年召开的全国科技创新大会提出，我国要在2030 年进入创新型国家前列，2050 年成为创新强国。实验室是高等学校实施素质教育、培养学生创新精神与实践能力的重要基地[1]，但常规的学生实验教学往往不能充分培养学生的创新能力。在当前国家大力推进大众创新创业的背景下，开设创新实验项目是高校培养学生协作能力、科研能力、创新能力以及综合素质的重要环节[2]。同时，教学和科研相辅相成，基于科研过程和科研成果的创新实验教学更有助于激发学生对知识的探索欲，加深学生对专业学科领域的认识，强化学生的创新意识，提升学生的创新思维[3]。促进科研与教学互动，把科研成果转化为实验教学内容，使实验教学从传统的“知识传授”转变为“知识、能力、思维、素质”综合素质培养，对推动大学生参与科学研究、营造良好的学术氛围、培养学生的创新精神具有深远意义，具有广阔的发展空间。
1 创新实验的设计背景及意义
合适的实验项目是创新实验开展的重要基础，创新实验设计结合新颖的科研内容，教学内容尚未涉及，具有一定的前瞻性，能引起学生主动探索未知的兴趣，并有利于培养学生的创新能力和综合素质，实现学生 “高分高能”的培养目标[4]。
BPA在工业上常被用来合成环氧树脂和聚碳酸醋等材料，从塑料袋、塑料饭盒、矿泉水瓶等日常用品，到医疗器械、食品包装的内衬等，生活中到处都有BPA的身影。BPA的大量生产和使用使它不断转移至环境，且大量研究已证明即便在极低剂量（ng/L）的存在下，BPA也能干扰人体及动物正常的内分泌系统，从而影响生殖功能，导致恶性肿瘤的产生等一系列严重损害，甚至具有遗传效应[5]。然而，在对环境样品中痕量的 BPA 进行分析的过程中，往往由于BPA的浓度较低甚至是微量、基质组成复杂而被干扰，常规检测方法达不到检测要求。因此，高效、灵敏、便捷的检测方法是开展BPA环境行为研究的基础和保障，同时，环境样品中BPA有效分离和富集的前处理至关重要。
分散液液微萃取（Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）技术作为一种新型的样品前处理手段，自Rezaee 等人于 2006 年首次提出以来迅速成为研究热点[6]。Leong等在此基础上建立了上浮溶剂固化分散液液微萃取技术（DLLME-SFO），采取低密度有机萃取剂，并在萃取离心后结合冷冻固化使萃取相凝固以方便移取。DLLME-SFO进一步简化了操作，具有样品需求量小、有机溶剂用量少、操作简便、萃取时间短、环境友好等突出[7]。本创新实验结合分散液液微萃取上浮溶剂固化（DLLME-SFO）的样品前处理方法和高效液相色谱法（HPLC）定量分析技术的联用，指导学生全程参与实验的各个环节，设计并优化样品前处理及HPLC仪器分析的各项参数，建立快捷高效的水样BPA检测方法。教师全程指导，学生全程参与实验设计及开展，全方位培养学生的“知识、能力、思维、素质”。同时，注重培养学生掌握文献查阅和Word、Excel等文本编辑方法，以及SPSS、ORIGIN等数据统计分析软件的使用，学习科研论文的基本组成和撰写。
2 实验原理及核心内容
本创新实验的核心内容是从两个方面进行参数优化确定：其一是BPA定量分析的HPLC仪器检测条件;另一方面是样品的DLLME-SFO前处理条件。
基于环境介质的复杂性以及环境样品中BPA浓度通常较低的特点，通过样品前处理需要达到分离和富集的目的，将BPA从样品中分离出来并去除基体干扰，同时还要达到一定程度的富集效果以满足后续定量检测方法的检出浓度。在进行样品中BPA检测的DLLME-SFO前处理条件优化时，主要通过富集倍数（Extraction Factor，EF）和萃取回收率（Extraction Recovery，ER）两项指标进行萃取效果的考察和比較[8]，进而确定优化的萃取条件。
EF为上浮萃取相中BPA的浓度与水样中BPA浓度的比值，Cfloated为萃取所得上浮相中BPA的浓度，C0为水样中BPA的浓度。
萃取回收率ER（%）为萃取相中BPA的量占水样中BPA量的百分比例，Mfloated为上浮萃取相中BPA的质量，M0为水样中BPA的质量。Vfloated和V0分别为萃取相的体积和水样体积。
样品经过DLLME-SFO前处理，其中的BPA分离富集至萃取相，并经由离心冷冻后取出，所得到的萃取相融化后即可进一步结合检测仪器进行定量分析。与气相色谱（GC）和气相色谱/质谱（GC/MS）等相比，高效液相色谱（HPLC）具有操作方便、测定时间短等优势。在确定BPA检测的HPLC色谱条件时，需重点考察并确定流动相的种类及流量、检测波长、柱温、进样量等参数;并建立优化条件下BPA测定的标准曲线，用于BPA的定量分析。
最后，还需对实验所建立的DLLME-SFO-HPLC检测方法进行评价。采用逐步稀释法结合高效液相色谱工作站，确定方法的检出限和定量限。结合加标回收实验，分析加标回收率和相对标准偏差。从方法的线性范围、检出限、实际样品加标回收率等方面进行所建检测方法的综合评价。
3 创新实验的整体设计
在教师的引导下，学生需全程参与文献查阅、实验详细设计、实验开展及实验总结汇报的各个环节，整体设计见下图，将复杂的综合性实验分解为几个步骤逐步开展。教师主要指导实验的整体思路及技术要点，并及时解答学生的疑问，详细的实验方案及操作由学生具体开展。
首先查阅相关文献，对BPA、DLLME-SFO、HPLC等背景信息进行梳理。进一步细化实验方案，对BPA的HPLC检测条件进行确定，从流动相、检测波长、柱温、进样量等因素进行条件优化，并基于优化的仪器条件进行标准曲线的建立。
在HPLC检测条件确定的基础上，进一步开展DLLME-SFO样品前处理方法的条件优化。结合实验，对萃取剂和分散剂的类型及萃取时间进行初步筛选，利用全因子实验以萃取回收率和富集倍数为指标对DLLME-SFO过程的萃取剂用量和分散剂用量进一步确定，再结合单因素实验考察pH值、盐離子强度、超声辅助条件的优化确定。采取上一步实验所确定的HPLC条件，定量检测各实验所得萃取相中的BPA，并结合萃取回收率ER和富集倍数EF进行萃取效果的评价和优化萃取条件确定。
最后根据实验过程及实验记录，形成实验报告，并针对其中的要点和亮点以PPT形式进行汇报及交流。
4 创新实验的开展
本创新实验项目采取学生组建团队的模式申请参加，按“项目背景调研—问题分析—文献查阅—实验方案细化—实验开展—数据分析—汇报总结”的顺序开展，并以科研论文的规范要求提交实验报告。
4.1 实验准备
教师下达“实验任务书”，简要介绍本创新实验的研究背景，实验的整体思路，实验过程需重点关注的因素。要求学生充分开展资料查阅和交流讨论，了解BPA及其研究现状，理解DLLME-SFO前处理的基本原理，掌握高效液相色谱法的基本原理和HPLC仪器的基本操作。在此基础上，由学生自行拟订详细实验方案，内容包括方法综述、理论依据、研究内容、实验步骤、操作方案、可行性分析、注意事项及参考文献等，并经教师审阅。
4.2 实验过程：
采用“引导-设计-探索-交流-引导”的模式，指导学生逐步细化实验方案并分步推进。先后依次开展BPA 的 HPLC 检测条件确定及标准曲线建立，DLLME 萃取剂、 分散剂的选用及用量确定，萃取条件的参数优化确定，所建立 DLLME-HPLC 方法的评价及水样中 BPA 的测定。每部分实验分别由小组的一名同学主要负责，并做到全员参与。实验过程充分调动学生的主动性，充分发挥学生的自主思考能力，尽量按照自己的思路开展实验。教师仅提供技术指导和整体进度把控，且指导方式多样化。比如，本实验的开展过程需大量使用高效液相色谱仪，教师制作了“HPLC 的操作及应用” 等教学微视频，辅助指导学生进行仪器操作，取得了较好的效果。又如，在HPLC流动相的选择和确定方面，由学生自行查阅资料提出几种备选方案，与教师讨论交流后，筛选出几种最可行的方案，再由学生展开实验进一步结合实验结果进行优化确定。同时，在实验过程中特别强调认真进行实验原始数据的记录，以便及时发现问题解决问题，并及时与指导教师汇报交流。
4.3 实验总结：
学生在实验后进一步梳理实验过程与结果，对异常现象进行讨论或提出创造性建议，将实验过程中遇到的问题及实验结论的得出过程进行详细分析。在此基础上，以论文的形式对实验结果归纳、总结与讨论，最后以 PPT 形式汇报交流。
5 结语
创新实验相较常规实验教学费时费力，但参与该实验的学生由被动参与者转变为实验路线的设计者和实验方案的制订者，学生积极思考、主动参与、相互探讨。实验过程有效激发学生的研究兴趣，充分发挥了学生的主动性和创造性。创新实验的开展，使学生对相关专业知识有了更深刻的理解，操作技能及合作精神得以强化，信息获得及利用的能力有所提高，创新思维及表达能力得到锻炼，视野进一步开阔，学习动力及学习方向更加明晰，为后续的学习及工作奠定了较好的基础。
参考文献：
[1]贾永霞. 创新性实验教学的探究与实践[J]. 实验室研究与探索， 2018， 37（12）：206-208.
[2]陈子辉， 王泽生. 基于创新实验项目的实验室开放机制研究[J]. 实验技术与管理， 2016， 33（1）：17-20.
[3]李旭， 张为公. 基于科研项目的数字电路创新型实验教学改革[J]. 实验室研究与探索， 2015， 34（1）：168-171.
[4]李从举. 以科研推动本科生的创新能力和综合素质的提高[J]. 实验室科学， 2011， 14（3）：1-4.
[5]杨清伟， 梅晓杏， 孙姣霞，等. 典型环境内分泌干扰物的来源、环境分布和主要环境过程[J]. 生态毒理学报， 2018， 13（3）：42-55.
[6]邓勃. 一种新的液液萃取模式-分散液液微萃取[J]. 现代科学仪器， 2010（3）：123-130.
[7]赵姗姗， 金炀， 王香，等. 分散液液微萃取应用的研究进展[J]. 中成药， 2020， 42（3）：180-185.
[8]马燕玲， 陈令新， 丁养军，等. 超声辅助分散液液微萃取——高效液相色谱测定水样中的4种邻苯二甲酸酯类增塑剂[J]. 色谱， 2013， 31（2）：155-161.
基金项目：本文系2019年重庆交通大学高等教育教学改革研究课题，项目名称：重庆交通大学高教所，综合设计性实验——水中双酚A的DLLME-HPLC检测方法建立及条件优化，项目编号：1903086;本文系2020年重庆市教育委员会科学技术研究项目，项目名称：重庆市教委，生物炭对消落带土壤吸附固定EDCs的影响研究，项目编号：KJQN202000743;本文系2021年重庆市中小学创新人才培养工程项目计划研究项目，重庆市教委，生物炭的制备及其对污染物的吸附性能，项目编号：CY210711。
作者简介：胡莺（1982— ），女，重庆人，博士，讲师，研究方向：新型污染物的环境行为及污染防控。