【摘 要】
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背景:前软骨干细胞虽然具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能,但生物学性状不稳定,易分化。导入外源性基因能使其永生化,且不改变细胞的表型和性状。目的:建立永生化大鼠前
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科;
【基金项目】
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Supported by: the General Program of the National Natural Science Foundation of China, No. 30571872~~
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背景:前软骨干细胞虽然具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能,但生物学性状不稳定,易分化。导入外源性基因能使其永生化,且不改变细胞的表型和性状。目的:建立永生化大鼠前软骨干细胞株,为以后精确调控前软骨干细胞的增殖与分化打下基础。设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-10/2006-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成。材料:出生<24h的新生SD大白鼠,雌雄不限,用于取前软骨干细胞。方法:用LipofectamineTM2000介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代前软骨干细胞进行稳定表达,用嘌呤霉素筛选出阳性克隆并扩大培养。主要观察指标:①前软骨干细胞的生物学性状。②质粒鉴定。③用免疫细胞化学方法和反转录聚合酶链反应鉴定SV40T抗原基因在转染细胞中的表达。④反转录聚合酶链反应结果。⑤细胞生长曲线。结果:①免疫磁珠分离获得细胞阳性克隆,用免疫组织化学证实FGFR-3表达阳性。②双酶切质粒,电泳证实pCMV为3kb,SV40T基因为2.3kb。③嘌呤霉素分离获得转化后细胞阳性克隆,用免疫组织化学证实FGFR-3表达阳性。④提取RNA后用反转录-聚合酶链反应法成功扩增出588bp的片段。转染细胞经扩大培养,命名为永生化前软骨干细胞。⑤贴壁培养的转染细胞群体倍增时间为(22.98±2.77)h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论:在体外培养条件下,可以从新生大鼠干骺端中分离、培养出前软骨干细胞,pCMVSV40T/PUR转染能使其永生化。
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