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摘 要：样品中的巴氯芬用0.01mol/L HCl溶液提取，提取液经WCX柱净化、富集后，进行液相色谱串联质谱（LC/MS-MS）分析。分析时采用BEH C18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm），以0.10%甲酸水/甲醇作为流动相进行梯度洗脱，电喷雾正电子（ESI+）模式电离，多反应监测（MRM）模式检测，内标法进行定量。结果表明：巴氯芬标准溶液在1.0～100.0μg/L范围内，峰面积与含量呈线性相关。猪肉和猪尿中巴氯芬检出限分别为0.30μg/kg和0.10μg/L，两种样品中添加回收率在85%～110%之间，相对标准偏差（RSD）小于10%。
关键词：液相色谱串联质谱；巴氯芬；猪肉；猪尿
Determination of Baclofen in Pork and Swine Urine by Liquid Chromatograpy Tandem Mass Spectrometry
XU Xiu-qing，WU Yin-liang*，YANG Ting，ZHU Yong，ZHAO Jian，YE Yu-fei
（Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China）
Abstract：A simple and sensitive LC-MS/MS method for the determination of baclofen in pork and swine urine was developed. Samples were extracted with 0.01 mol/L HCl solution， purified with a WCX cartridge and analyzed by LC/MS-MS on a Waters
Acquity BEH C18 column with 0.10% formic acid in water/methanol as the mobile phase by means of gradient elution. Detection was carried out with an electrospray ionisation （ESI） probe and operated in the positive ion mode. Baclofen was quantified by the internal standard method. There was a good linearity in the range of concentrations between 1.0 and 100.0 μg/L. The limits of detection for baclofen were 0.30 μg/kg and 0.10 μg/L in pork and swine urine， respectively. The recoveries from spiked samples were in the range of 85% to 110% and the relative standard deviations were lower than 10%. These results showed that the method was simple， rapid， sensitive and reliable for monitoring residual baclofen in pork and swine urine.
Key words：LC-MS/MS；baclofen；pork；swine urine
中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）09-0022-04
巴氯芬（baclofen），商品名力奥来素（lioresal），化学名β-4-氯-苯基-γ-氨基丁酸，是γ-氨基丁酸的取代衍生物，化学结构式见图1。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳动物中枢神经系统最重要的抑制性氨基酸神经递质，通过与其3个特异性受体GABA-A、GABA-B、GABA-C相互作用而发挥重要的生理活性。巴氯芬是第1个应用于临床的选择性GABA-B受体激动剂，曾作为肌松药用于临床[1]。在动物上使用，可以达到促进动物生长、调节食欲、抗应激的作用[2]。但是，在动物饲料或者兽药中使用此药，可对人体健康产生一定的危害。有文献报道[3-5]长期食用巴氯芬会导致嗜睡、眩晕、呕吐、乏力、低血压、精神错乱等，严重时可导致类似脑死亡的症状出现。因此，为保护人们身体健康，有必要建立动物源性食品中巴氯芬药物残留的定性、定量分析方法。
图 1 巴氯芬化学结构式
Fig.1 The chemical structural formula of baclofen
Sagirli等[6]、Yagi等[7]、Carlsson等[8]应用液相色谱法测定了人血及尿液中的加巴喷丁，Miksa等[9]应用液相色谱质谱法测定了牛血中的巴氯芬和异丙基甲丁双脲，Goda等[10]应用液相色谱质谱法测定人血中的巴氯芬的S（+）-和R（-）-对映异构体。液相色谱串联质谱（LC-MS-MS）法作为1种选择性强灵敏度高的分析手段，已被广泛的应用于测定各种药物分析和药物残留分析[11-24]。目前对于饲料和猪尿中的巴氯芬分析已有液相色谱串联质谱法的报道，如农业部1862号公告中建立了饲料中的巴氯芬LC-MS/MS测定方法[25]，夏骏等[26]建立了固相萃取-液相色谱串联质谱法测定猪尿中巴氯芬的残留分析方法，但目前对于猪肉中的巴氯芬LC-MS/MS分析方法尚未见相关报道。本实验采用固相萃取净化，建立了猪肉和猪尿中LC-MS/MS分析方法，整个方法具有简便、快速、检出限低、准确度和精密度好的特点。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪肉样品购于宁波市江东家乐福超市，猪尿样品为农业部“无公害食品行动计划”湖北抽检样品。
巴氯芬（纯度>99%）、加巴喷丁-D4标准品（纯度>99%） 加拿大Toronto Research Chemicals公司；甲醇、乙腈（色谱纯） 美国默克公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UPLC XevoTM TQ MS超高效液相色谱串联质谱仪美国Waters公司；SIGMA3K15离心机 北京博励行有限公司；RT SPE全自动固相萃取仪 美国Caliper公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；固相萃取柱Oasis?WCX（3mL，500mg）、Oasis?MCX（3mL，500mg） 美国Waters公司；Cleanert SCX（3mL，500mg） 北京艾杰尔科技有限公司；CNWBOND HC-C18（3mL，200mg） 上海安谱科学仪器公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
1.3.1.1 标准储备液
称取巴氯芬和加巴喷丁-D4标准品各10.0mg，分别用乙腈定容至刻度，即成质量浓度100mg/L的标准储备液，-18℃条件下保存，保质期为6个月。
1.3.1.2 标准工作液
用0.1%甲酸水/甲醇（80：20，V/V）稀释巴氯芬标准储备液配制质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L的标准工作液，各标准工作液中加10μg/L加巴喷丁-D4，现配现用。
1.3.2 样品前处理
1.3.2.1 猪尿样品前处理
吸取猪尿样品2.0mL，加入100μL质量浓度100μg/L的内标工作液，用0.5mol/L HCl溶液调节pH值至4.0后过经6mL甲醇和6mL 0.01mol/L HCl溶液活化的WCX柱，样品全部上样后，依次用3mL水清洗，3mL 20%甲醇水清洗，抽干后用5mL 2.0mol/L乙酸甲醇溶液洗脱，洗脱液于40℃水浴中氮气吹干，最后用1mL 0.1%甲酸水/甲醇（80：20，V/V）定容，过0.22μm滤膜后上机测定。
1.3.2.2 猪肉样品前处理
称取猪肉样品2g。加入100μL质量浓度100μg/L的内标工作液，再加入10mL 0.01mol/L HCl溶液，均质1min后振荡提取30min，再以8000r/min离心5min，收集上清液，加入10mL 0.01mol/L HCl溶液再按上述方法提取，合并2次提取液，混匀。取5mL提取液按1.3.2.1中方法过MCX小柱。
1.3.3 仪器条件
1.3.3.1 液相色谱条件
色谱柱Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100mm× 2.1mm，1.7μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）（梯度洗脱）；梯度洗脱程序：0～0.5min，20%甲醇；0.5～2.5min，20%～50%甲醇，保持1.0min；3.5～3.6min，50%～20%甲醇；再保持1.4min。流速：0.2mL/min，柱温：25℃；进样量10μL。
1.3.3.2 质谱条件
质谱条件优化时采用1000μg/L的巴氯芬和加巴喷丁-D4标准工作溶液，利用IntelliStart软件进行优化。
电离模式：ESI正离子模式；多级反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）。毛细管电压1.5kV，离子源温度150℃，去溶剂气温度500℃，去溶剂气流速为1000L/h，碰撞气流速0.20mL/min，放大倍数为600。其他条件详见表1。
2 结果与分析
2.1 样品前处理过程的优化
2.1.1 提取溶剂的选择
巴氯芬微溶于水，易溶于酸性及碱性水溶液。因此实验首先猪尿样品pH值调至4、5、6、7、8、9后过WCX柱，结果表明随着pH值在4～6范围内样品回收率均较好，且变化不大，但随着pH值至中性或碱性后，样品添加回收率迅速下降，因此本实验对猪尿样品进行酸化处理（pH4.0）后过MCX小柱。同样猪肉样品（10μg/kg添加水平）经两种提取溶液（0.01mol/L HCl溶液和50mmol/L磷酸盐缓冲液，pH8.0）提取后过MCX小柱，结果表明两种溶液处理方式巴氯芬的添加回收率分别为92.1%和0%，因此本实验选择0.01mol/L HCl溶液进行提取。
2.1.2 固相萃取小柱的选择
取猪尿样品2mL，添加巴氯芬标准溶液，使添加质量浓度为10μg/L，然后调节猪尿样品pH值至4.0后过WCX、MCX、SCX、C18小柱，结果表明巴氯芬经前3种小柱处理后的添加回收率分别为95.3%、94.2%、92.3%，而C18小柱的回收率仅有56.7%，本实验选择WCX小柱进行实验。
2.2 仪器条件的选择
巴氯芬和加巴喷丁-D4在电喷雾离子源正离子模式下能获得较好的电离，而在电喷雾离子源负离子模式下难以电离，因此本实验选择正离子模式进行实验。同时经IntelliStart软件优化后，获得了两种化合物的最佳质谱条件。
在最优质谱条件后，实验选择Acquity HSS T3（2.1mm× 100mm，1.8μm）柱和Acquity BEH C18 （2.1mm×100mm，
1.7μm）柱进行比较。结果发现，在相同的流动相和色谱条件下，巴氯芬在Acquity HSS T3柱上的响应明显低于在Acquity BEH C18柱；同时实验发现巴氯芬在甲酸水/乙腈体系中的灵敏度明显低于在甲酸水/甲醇体系，因此实验选择Acquity BEH C18柱和0.1%甲酸水/甲醇体系进行实验。 2.3 方法参数
2.3.1 标准曲线与线性范围
用0.1%甲酸水/甲醇（80：20，V/V）配制各标准工作液经LC-MS-MS测定，以质量浓度为横坐标，以巴氯芬定量离子对峰面积和内标离子对峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数，其中回归方程为y=0.2214ρ+0.0117，相关系数R2=0.9994。
2.3.2 灵敏度
根据测定标准曲线所得的结果，配制相近质量浓度的阳性添加样品，测定其实际信噪比。以RSN不小于3为检测限，以RSN不小于10为定量限。结果表明，猪尿样品中巴氯芬的检出限为0.10μg/L，定量限为0.30μg/L；猪肉样品中巴氯芬的检出限为0.30μg/kg，定量限为1.0μg/kg。
2.3.3 精密度和回收率
取猪尿样品和猪肉样品，加入标准工作溶液配制成1.0、2.0、4.0μg/L（kg）的加标样品，按照1.3.2节步骤进行操作，每个添加水平重复3次，每次每个质量浓度5个加标样品进行定量分析。结果表明批内和批间的变异系数均小于10%，回收率均在85%～110%之间，具体结果详见表2、表3。样品添加图谱详见图2。
b中巴氯芬添加量为4μg/kg。
图 2 猪肉空白样品（a）和猪肉添加巴氯芬样品（b）MRM色谱图
Fig.2 MRM chromatograms of blank sample （a） and fortified
sample （b） of pork
3 结 论
建立了猪尿和猪肉样品中巴氯芬的快速测定LC-MS/MS方法。猪尿样品经酸化后直接进行WCX小柱净化，猪肉样品经0.01mol/L HCl溶液提取后进行WCX小柱净化，洗脱液吹干复溶后进行LC-MS-MS法测定。该方法具有快速、灵敏、准确的特点，可适用于我国对巴氯芬在动物生产中非法使用的监控要求。
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关键词：液相色谱串联质谱；巴氯芬；猪肉；猪尿
Determination of Baclofen in Pork and Swine Urine by Liquid Chromatograpy Tandem Mass Spectrometry
XU Xiu-qing，WU Yin-liang*，YANG Ting，ZHU Yong，ZHAO Jian，YE Yu-fei
（Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China）
Abstract：A simple and sensitive LC-MS/MS method for the determination of baclofen in pork and swine urine was developed. Samples were extracted with 0.01 mol/L HCl solution， purified with a WCX cartridge and analyzed by LC/MS-MS on a Waters
Acquity BEH C18 column with 0.10% formic acid in water/methanol as the mobile phase by means of gradient elution. Detection was carried out with an electrospray ionisation （ESI） probe and operated in the positive ion mode. Baclofen was quantified by the internal standard method. There was a good linearity in the range of concentrations between 1.0 and 100.0 μg/L. The limits of detection for baclofen were 0.30 μg/kg and 0.10 μg/L in pork and swine urine， respectively. The recoveries from spiked samples were in the range of 85% to 110% and the relative standard deviations were lower than 10%. These results showed that the method was simple， rapid， sensitive and reliable for monitoring residual baclofen in pork and swine urine.
Key words：LC-MS/MS；baclofen；pork；swine urine
中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）09-0022-04
巴氯芬（baclofen），商品名力奥来素（lioresal），化学名β-4-氯-苯基-γ-氨基丁酸，是γ-氨基丁酸的取代衍生物，化学结构式见图1。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳动物中枢神经系统最重要的抑制性氨基酸神经递质，通过与其3个特异性受体GABA-A、GABA-B、GABA-C相互作用而发挥重要的生理活性。巴氯芬是第1个应用于临床的选择性GABA-B受体激动剂，曾作为肌松药用于临床[1]。在动物上使用，可以达到促进动物生长、调节食欲、抗应激的作用[2]。但是，在动物饲料或者兽药中使用此药，可对人体健康产生一定的危害。有文献报道[3-5]长期食用巴氯芬会导致嗜睡、眩晕、呕吐、乏力、低血压、精神错乱等，严重时可导致类似脑死亡的症状出现。因此，为保护人们身体健康，有必要建立动物源性食品中巴氯芬药物残留的定性、定量分析方法。
图 1 巴氯芬化学结构式
Fig.1 The chemical structural formula of baclofen
Sagirli等[6]、Yagi等[7]、Carlsson等[8]应用液相色谱法测定了人血及尿液中的加巴喷丁，Miksa等[9]应用液相色谱质谱法测定了牛血中的巴氯芬和异丙基甲丁双脲，Goda等[10]应用液相色谱质谱法测定人血中的巴氯芬的S（+）-和R（-）-对映异构体。液相色谱串联质谱（LC-MS-MS）法作为1种选择性强灵敏度高的分析手段，已被广泛的应用于测定各种药物分析和药物残留分析[11-24]。目前对于饲料和猪尿中的巴氯芬分析已有液相色谱串联质谱法的报道，如农业部1862号公告中建立了饲料中的巴氯芬LC-MS/MS测定方法[25]，夏骏等[26]建立了固相萃取-液相色谱串联质谱法测定猪尿中巴氯芬的残留分析方法，但目前对于猪肉中的巴氯芬LC-MS/MS分析方法尚未见相关报道。本实验采用固相萃取净化，建立了猪肉和猪尿中LC-MS/MS分析方法，整个方法具有简便、快速、检出限低、准确度和精密度好的特点。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪肉样品购于宁波市江东家乐福超市，猪尿样品为农业部“无公害食品行动计划”湖北抽检样品。
巴氯芬（纯度>99%）、加巴喷丁-D4标准品（纯度>99%） 加拿大Toronto Research Chemicals公司；甲醇、乙腈（色谱纯） 美国默克公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UPLC XevoTM TQ MS超高效液相色谱串联质谱仪美国Waters公司；SIGMA3K15离心机 北京博励行有限公司；RT SPE全自动固相萃取仪 美国Caliper公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；固相萃取柱Oasis?WCX（3mL，500mg）、Oasis?MCX（3mL，500mg） 美国Waters公司；Cleanert SCX（3mL，500mg） 北京艾杰尔科技有限公司；CNWBOND HC-C18（3mL，200mg） 上海安谱科学仪器公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
1.3.1.1 标准储备液
称取巴氯芬和加巴喷丁-D4标准品各10.0mg，分别用乙腈定容至刻度，即成质量浓度100mg/L的标准储备液，-18℃条件下保存，保质期为6个月。
1.3.1.2 标准工作液
用0.1%甲酸水/甲醇（80：20，V/V）稀释巴氯芬标准储备液配制质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L的标准工作液，各标准工作液中加10μg/L加巴喷丁-D4，现配现用。
1.3.2 样品前处理
1.3.2.1 猪尿样品前处理
吸取猪尿样品2.0mL，加入100μL质量浓度100μg/L的内标工作液，用0.5mol/L HCl溶液调节pH值至4.0后过经6mL甲醇和6mL 0.01mol/L HCl溶液活化的WCX柱，样品全部上样后，依次用3mL水清洗，3mL 20%甲醇水清洗，抽干后用5mL 2.0mol/L乙酸甲醇溶液洗脱，洗脱液于40℃水浴中氮气吹干，最后用1mL 0.1%甲酸水/甲醇（80：20，V/V）定容，过0.22μm滤膜后上机测定。
1.3.2.2 猪肉样品前处理
称取猪肉样品2g。加入100μL质量浓度100μg/L的内标工作液，再加入10mL 0.01mol/L HCl溶液，均质1min后振荡提取30min，再以8000r/min离心5min，收集上清液，加入10mL 0.01mol/L HCl溶液再按上述方法提取，合并2次提取液，混匀。取5mL提取液按1.3.2.1中方法过MCX小柱。
1.3.3 仪器条件
1.3.3.1 液相色谱条件
色谱柱Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100mm× 2.1mm，1.7μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）（梯度洗脱）；梯度洗脱程序：0～0.5min，20%甲醇；0.5～2.5min，20%～50%甲醇，保持1.0min；3.5～3.6min，50%～20%甲醇；再保持1.4min。流速：0.2mL/min，柱温：25℃；进样量10μL。
1.3.3.2 质谱条件
质谱条件优化时采用1000μg/L的巴氯芬和加巴喷丁-D4标准工作溶液，利用IntelliStart软件进行优化。
电离模式：ESI正离子模式；多级反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）。毛细管电压1.5kV，离子源温度150℃，去溶剂气温度500℃，去溶剂气流速为1000L/h，碰撞气流速0.20mL/min，放大倍数为600。其他条件详见表1。
2 结果与分析
2.1 样品前处理过程的优化
2.1.1 提取溶剂的选择
巴氯芬微溶于水，易溶于酸性及碱性水溶液。因此实验首先猪尿样品pH值调至4、5、6、7、8、9后过WCX柱，结果表明随着pH值在4～6范围内样品回收率均较好，且变化不大，但随着pH值至中性或碱性后，样品添加回收率迅速下降，因此本实验对猪尿样品进行酸化处理（pH4.0）后过MCX小柱。同样猪肉样品（10μg/kg添加水平）经两种提取溶液（0.01mol/L HCl溶液和50mmol/L磷酸盐缓冲液，pH8.0）提取后过MCX小柱，结果表明两种溶液处理方式巴氯芬的添加回收率分别为92.1%和0%，因此本实验选择0.01mol/L HCl溶液进行提取。
2.1.2 固相萃取小柱的选择
取猪尿样品2mL，添加巴氯芬标准溶液，使添加质量浓度为10μg/L，然后调节猪尿样品pH值至4.0后过WCX、MCX、SCX、C18小柱，结果表明巴氯芬经前3种小柱处理后的添加回收率分别为95.3%、94.2%、92.3%，而C18小柱的回收率仅有56.7%，本实验选择WCX小柱进行实验。
2.2 仪器条件的选择
巴氯芬和加巴喷丁-D4在电喷雾离子源正离子模式下能获得较好的电离，而在电喷雾离子源负离子模式下难以电离，因此本实验选择正离子模式进行实验。同时经IntelliStart软件优化后，获得了两种化合物的最佳质谱条件。
在最优质谱条件后，实验选择Acquity HSS T3（2.1mm× 100mm，1.8μm）柱和Acquity BEH C18 （2.1mm×100mm，
1.7μm）柱进行比较。结果发现，在相同的流动相和色谱条件下，巴氯芬在Acquity HSS T3柱上的响应明显低于在Acquity BEH C18柱；同时实验发现巴氯芬在甲酸水/乙腈体系中的灵敏度明显低于在甲酸水/甲醇体系，因此实验选择Acquity BEH C18柱和0.1%甲酸水/甲醇体系进行实验。 2.3 方法参数
2.3.1 标准曲线与线性范围
用0.1%甲酸水/甲醇（80：20，V/V）配制各标准工作液经LC-MS-MS测定，以质量浓度为横坐标，以巴氯芬定量离子对峰面积和内标离子对峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数，其中回归方程为y=0.2214ρ+0.0117，相关系数R2=0.9994。
2.3.2 灵敏度
根据测定标准曲线所得的结果，配制相近质量浓度的阳性添加样品，测定其实际信噪比。以RSN不小于3为检测限，以RSN不小于10为定量限。结果表明，猪尿样品中巴氯芬的检出限为0.10μg/L，定量限为0.30μg/L；猪肉样品中巴氯芬的检出限为0.30μg/kg，定量限为1.0μg/kg。
2.3.3 精密度和回收率
取猪尿样品和猪肉样品，加入标准工作溶液配制成1.0、2.0、4.0μg/L（kg）的加标样品，按照1.3.2节步骤进行操作，每个添加水平重复3次，每次每个质量浓度5个加标样品进行定量分析。结果表明批内和批间的变异系数均小于10%，回收率均在85%～110%之间，具体结果详见表2、表3。样品添加图谱详见图2。
b中巴氯芬添加量为4μg/kg。
图 2 猪肉空白样品（a）和猪肉添加巴氯芬样品（b）MRM色谱图
Fig.2 MRM chromatograms of blank sample （a） and fortified
sample （b） of pork
3 结 论
建立了猪尿和猪肉样品中巴氯芬的快速测定LC-MS/MS方法。猪尿样品经酸化后直接进行WCX小柱净化，猪肉样品经0.01mol/L HCl溶液提取后进行WCX小柱净化，洗脱液吹干复溶后进行LC-MS-MS法测定。该方法具有快速、灵敏、准确的特点，可适用于我国对巴氯芬在动物生产中非法使用的监控要求。
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