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摘要：目的利用制川乌、制草乌（双乌）组合给药治疗大鼠佐剂型关节炎（AA）并探讨其药效强弱及作用方式。方法制备佐剂性关节炎大鼠模型，给药治疗后检测血清细胞因子TNF-α、IL-2、IL-4的水平并观察大鼠体重和足跖的变化情况。结果随着双乌的治疗各组大鼠血清TNF-α、IL-2的水平呈下降趋势，而IL-4水平变化不明显；各组大鼠左后足的足跖肿胀程度显著减轻，各组大鼠的体重没有显著性差异。结论双乌对大鼠佐剂型关节炎有明显的治疗作用，抑制炎性因子（IL-2、TNF-α）产生而不是促进抑炎因子（IL-4）生成可能是其治疗类风湿关节炎（RA）的主因。
关键词：双乌；关节炎；细胞因子；治疗作用
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）01-0076-03
【Abstract】Objective：To study the effect of Radix Aconiti Preparata and Radix Aconiti Kusnezoffii on the adjuvant arthritis（AA）in rats and its pesticide effect and mode of action. Methods：AA rat model was established. After the rats were administrated，their TNF-α，IL-2 and IL-4 in serum were measured and the changes of body weight and paw were observed. Results：With the treatment of the two herbs，the levels of serum TNF-α and IL-2 decreased while the level of IL-4 did not change significantly. And the swelling of the left hind paw of each group significantly alleviated，but their body weight was no significant differences. Conclusion：Radix Aconiti Preparata and Radix Aconiti Kusnezoffii have an obvious therapeutic effect on adjuvant arthritis in rats and can inhibit the production of IL-2 and TNF-α rather than promote the production of IL，which may be major cause for the treatment of RA.
【Key words】Radix Aconiti Preparata and Radix Aconiti Kusnezoffii，arthritis，cytokine，therapeutic effect
制川烏为川乌的炮制加工品，制草乌属草乌的炮制加工品，这两味药均具有祛风除湿，温经止痛的功效，临床上常被用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等痹症[1，2]。但对于其治疗类风湿关节炎等疾病的主要方式到底是偏抗炎作用还是偏免疫作用，目前仍不完全清楚。本文将通过以下实验来探讨双乌组合治疗类风湿关节炎的药效强弱及作用方式，为双乌在临床上的治疗类风湿等疾病的应用提供一定的理论依据。
1材料与方法
1.1药物及试剂制川乌提取物（批号 12090061），制草乌提取物（批号：12090062），广东一方公司生产；雷公藤多苷片（批号：120301），黄石飞云公司生产；Freund’s完全佐剂，SIGMA-ALDRCH公司生产；TNF-α、IL-2、IL-4试剂盒，RND公司生产；制川乌和制草乌的混合配比为1：1。
1.2动物Wistar大鼠（SPF级）雌雄各半，体重180～220 g，由南方医科大学实验动物中心提供。
1.3大鼠AA模型制备根据文献[3]中制备方法利用弗氏完全佐剂，于每鼠左后足跖皮内注射0.1 mL致炎。
1.4分组与给药剂量大鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半，即空白组、模型组、雷公藤多苷片组、双乌治疗高剂量组、双乌治疗中剂量组、双乌治疗低剂量组。给药浓度分别为双乌治疗低剂量组0.30 g/kg，双乌治疗中剂量组0.90 g/kg，双乌治疗高剂量组2.70 g/kg；雷公藤组给予雷公藤多苷片混悬液9.00 mg/kg灌服；给药体积为2 mL/250 g。空白组、模型组以2 mL/250 g蒸馏水给大鼠灌胃[4，5]。连续灌胃给药35 d，于第36 d对大鼠进行相应处理。
1.5体重及炎症反应指标检测实验开始时每7 d称量一次各鼠的体重；AA 大鼠模型建立后每隔7 d分别测量左后足足跖的厚度，每次测量部位不变，专人负责测定并加以记录[6]。
1.6样本采集经腹主动脉采血后，离心分离得到血清并作标记。同时打开关节腔，取出滑膜组织，将取下的滑膜以10%甲醛固定，EDTA脱钙，乙醇逐级脱水，常规包埋，石蜡切片，厚度为5 Lm，裱于干净载玻片上，60℃恒温箱烤片4 h，备用。
1.7细胞因子检测血清中TNF-α、IL-2、IL-4水平[7，9]按ELISA试剂盒说明书进行检测。病理切片：常规HE染色。
1.8统计学方法实验数据以（x±s）表示，用SPSS16.0统计软件进行统计学处理。显著性检验采用单因素方差分析，组间方差分析用F检验，有差异的两两比较用t检验。 2实验结果
2.1大鼠体重测量结果体重作为一种常规的实验检测指标，可以反映出一种药物的有效性和安全性[8]。通过体重的增减变化，反映该药对机体免疫功能的调节作用及对胃肠道等消化吸收系统的影响。实验数据表明，在整个实验期间，各组动物体重变化均无显著差异。见图1：
2.2给药对AA大鼠继发炎症反应的影响足趾肿胀度是反应AA模型后肢炎症轻重程度的外部客观指标[6]。实验结果表明：模型组大鼠的右后足（注射足）在致炎后开始发红并逐渐肿胀，造模24h左右达到高峰，各组肿胀与正常组相比具有极显著差异（P<0.01），表明造模非常成功。造膜第14d后开始给药，一天一次，连续给药35d。实验结果表明：和模型组比较，给药14d后双乌低剂量能够显著降低足跖肿胀程度（P<0.05），雷公藤阳性组、双乌中剂量组体现出极显著差异（P<0.01）；给药21d后雷公藤阳性组、双乌中剂量、双乌高剂量组体现出了极显著差异（P<0.01）；实验反应出双乌组合能够显著降低大鼠左后足的足跖肿胀程度，有很好的抗炎效果。见表1。
2.3大鼠血清细胞因子TNF-α、IL-2、IL-4水平检测实验结果表明：与空白组相比较，模型组大鼠血清中 TNF-ɑ和IL-2含量明显增高，有极显著差异（P<0.01），IL-4的差异不明显。与模型组相比较，双乌中、高剂量组能显著降低大鼠血清中 TNF-ɑ 含量（P<0.05），雷公藤阳性组能极显著降低大鼠血清中 TNF-ɑ 含量（P<0.01）。与空白组相比较，模型组大鼠血清中 IL-2 含量明显增高，有极显著差异（P<0.01）。与模型组相比较，双乌中、高剂量组能极显著降低大鼠血清中 IL-2含量（P<0.01），雷公藤阳性组能显著降低大鼠血清中 IL-2含量（P<0.05）。与空白组相比较，其它各组大鼠血清中IL-4的含量没有明显差异（P>0.05）。见表2。
2.4各组对大鼠关节滑膜组织病理形态的影响实验结果表明：镜下观察到空白组滑膜组织未见异常。模型组大鼠滑膜组织可见滑膜充血，滑膜增厚明顯，炎症细胞浸润，关节软骨破坏严重。阳性组大鼠可见滑膜细胞增生不明显，炎症细胞浸润明显减少。各双乌给药治疗组的滑膜充血、水肿均有不同程度减轻，淋巴细胞浸润明显减少，未见关节软骨破坏，与模型组比较均差异性显著，有统计学意义。病理学结果表明双乌组合给药能够明显改善AA大鼠关节的滑膜病变程度。结果见图2。
3讨论
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性多关节炎症为主要表现的全身性自身免疫性疾病，RA 在世界范围内的平均患病率约1%，我国的发病率为0.32%-0.36%，是一种致残率较高的疾病，严重影响患者的生活质量。西药受不良反应的限制较大，其毒副作用明显，患者难以长期耐受，中医药治疗此病具有独特优势，如副作用少、适宜长期服用等，使得中医药治疗此病成为近年来国内、外学者研究的主要方向[9]。
实验的体重测量结果反应出双乌组合给药具有安全性，不会对实验动物的体重以及消化系统等造成不良影响[10]。右后足足跖肿胀厚度测量结果表明，给药后各治疗组在21d和28d时体现出显著疗效，和膜型组比较有显著差异。大鼠血清细胞因子（TNF-α、IL-2、IL-4）检测结果表明，双乌中、高剂量组能显著降低大鼠血清中 TNF-ɑ及 IL-2含量，但对IL-4的含量没有明显影响。整个实验结果表明方剂治疗大鼠类风湿关节炎的机制主要与抑制炎性因子（IL-2、TNF-α）的产生与释放密切相关，而不是体现在保护或促进抑炎因子（IL-4）生成方面。
参考文献：
[1]孙琳，张杰.类风湿关节炎中西医治疗研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2013，15（4）：129-131.
[2]刘建磊，李宝丽.制附子对类风湿关节炎抗炎作用的实验研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（17）：184-186.
[3]吴湘慧，李娟，庞捷.类风湿关节炎大鼠模型的构建及昆明山海棠对大鼠佐剂性关节炎的干预研究[J].中药材，2009，32（5）：758-760.
[4]郭淑芳，杨彤.用鼠耳肿胀法研究抗炎药实验方法的改进[J].实验动物科学与管理，2003，20（3）：42-43.
[5]金桂芳，张文军，谭毓.鼻炎康片抗炎镇痛药效研究[J].中药材，2009，32（7）：1108-1111.
[6]陈刚，殷钟意，郑旭煦.柑橘皮总黄酮对大鼠佐剂性关节炎的影响及机制研究[J].中国中药杂志，2010，35（10）：1298-1300.[6]陈腊霞，王燕燕.中医药治疗类风湿性关节炎的研究进展[J].中国药房，2013，24（15）：1420-1422.
[7]张国恩，杨德华，钱玉中.痹康饮合剂对佐剂性关节炎大鼠的实验研究[J].北京中医药大学学报.2006，29（2）：104-106.
[8]高艳青，司银楚，牛欣.半夏泻心汤及其类方不同配伍对正常大鼠胃液成分的影响[J].北京中医药大学学报，2006，29（3）：168.
[9]吴斌，朱宁，张俊，等.99锝-亚甲基二磷酸盐对类风湿关节炎患者血清TNF-α和IL-6的影响[J].实用医学杂志，2012，28（2）：295-298.
[10]王振亮，姚乃礼.石藤胶囊对佐剂性关节炎大鼠 TNF-α，IL-1β的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（8）：195-197.
（收稿日期：2016-10-24）
关键词：双乌；关节炎；细胞因子；治疗作用
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）01-0076-03
【Abstract】Objective：To study the effect of Radix Aconiti Preparata and Radix Aconiti Kusnezoffii on the adjuvant arthritis（AA）in rats and its pesticide effect and mode of action. Methods：AA rat model was established. After the rats were administrated，their TNF-α，IL-2 and IL-4 in serum were measured and the changes of body weight and paw were observed. Results：With the treatment of the two herbs，the levels of serum TNF-α and IL-2 decreased while the level of IL-4 did not change significantly. And the swelling of the left hind paw of each group significantly alleviated，but their body weight was no significant differences. Conclusion：Radix Aconiti Preparata and Radix Aconiti Kusnezoffii have an obvious therapeutic effect on adjuvant arthritis in rats and can inhibit the production of IL-2 and TNF-α rather than promote the production of IL，which may be major cause for the treatment of RA.
【Key words】Radix Aconiti Preparata and Radix Aconiti Kusnezoffii，arthritis，cytokine，therapeutic effect
制川烏为川乌的炮制加工品，制草乌属草乌的炮制加工品，这两味药均具有祛风除湿，温经止痛的功效，临床上常被用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等痹症[1，2]。但对于其治疗类风湿关节炎等疾病的主要方式到底是偏抗炎作用还是偏免疫作用，目前仍不完全清楚。本文将通过以下实验来探讨双乌组合治疗类风湿关节炎的药效强弱及作用方式，为双乌在临床上的治疗类风湿等疾病的应用提供一定的理论依据。
1材料与方法
1.1药物及试剂制川乌提取物（批号 12090061），制草乌提取物（批号：12090062），广东一方公司生产；雷公藤多苷片（批号：120301），黄石飞云公司生产；Freund’s完全佐剂，SIGMA-ALDRCH公司生产；TNF-α、IL-2、IL-4试剂盒，RND公司生产；制川乌和制草乌的混合配比为1：1。
1.2动物Wistar大鼠（SPF级）雌雄各半，体重180～220 g，由南方医科大学实验动物中心提供。
1.3大鼠AA模型制备根据文献[3]中制备方法利用弗氏完全佐剂，于每鼠左后足跖皮内注射0.1 mL致炎。
1.4分组与给药剂量大鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半，即空白组、模型组、雷公藤多苷片组、双乌治疗高剂量组、双乌治疗中剂量组、双乌治疗低剂量组。给药浓度分别为双乌治疗低剂量组0.30 g/kg，双乌治疗中剂量组0.90 g/kg，双乌治疗高剂量组2.70 g/kg；雷公藤组给予雷公藤多苷片混悬液9.00 mg/kg灌服；给药体积为2 mL/250 g。空白组、模型组以2 mL/250 g蒸馏水给大鼠灌胃[4，5]。连续灌胃给药35 d，于第36 d对大鼠进行相应处理。
1.5体重及炎症反应指标检测实验开始时每7 d称量一次各鼠的体重；AA 大鼠模型建立后每隔7 d分别测量左后足足跖的厚度，每次测量部位不变，专人负责测定并加以记录[6]。
1.6样本采集经腹主动脉采血后，离心分离得到血清并作标记。同时打开关节腔，取出滑膜组织，将取下的滑膜以10%甲醛固定，EDTA脱钙，乙醇逐级脱水，常规包埋，石蜡切片，厚度为5 Lm，裱于干净载玻片上，60℃恒温箱烤片4 h，备用。
1.7细胞因子检测血清中TNF-α、IL-2、IL-4水平[7，9]按ELISA试剂盒说明书进行检测。病理切片：常规HE染色。
1.8统计学方法实验数据以（x±s）表示，用SPSS16.0统计软件进行统计学处理。显著性检验采用单因素方差分析，组间方差分析用F检验，有差异的两两比较用t检验。 2实验结果
2.1大鼠体重测量结果体重作为一种常规的实验检测指标，可以反映出一种药物的有效性和安全性[8]。通过体重的增减变化，反映该药对机体免疫功能的调节作用及对胃肠道等消化吸收系统的影响。实验数据表明，在整个实验期间，各组动物体重变化均无显著差异。见图1：
2.2给药对AA大鼠继发炎症反应的影响足趾肿胀度是反应AA模型后肢炎症轻重程度的外部客观指标[6]。实验结果表明：模型组大鼠的右后足（注射足）在致炎后开始发红并逐渐肿胀，造模24h左右达到高峰，各组肿胀与正常组相比具有极显著差异（P<0.01），表明造模非常成功。造膜第14d后开始给药，一天一次，连续给药35d。实验结果表明：和模型组比较，给药14d后双乌低剂量能够显著降低足跖肿胀程度（P<0.05），雷公藤阳性组、双乌中剂量组体现出极显著差异（P<0.01）；给药21d后雷公藤阳性组、双乌中剂量、双乌高剂量组体现出了极显著差异（P<0.01）；实验反应出双乌组合能够显著降低大鼠左后足的足跖肿胀程度，有很好的抗炎效果。见表1。
2.3大鼠血清细胞因子TNF-α、IL-2、IL-4水平检测实验结果表明：与空白组相比较，模型组大鼠血清中 TNF-ɑ和IL-2含量明显增高，有极显著差异（P<0.01），IL-4的差异不明显。与模型组相比较，双乌中、高剂量组能显著降低大鼠血清中 TNF-ɑ 含量（P<0.05），雷公藤阳性组能极显著降低大鼠血清中 TNF-ɑ 含量（P<0.01）。与空白组相比较，模型组大鼠血清中 IL-2 含量明显增高，有极显著差异（P<0.01）。与模型组相比较，双乌中、高剂量组能极显著降低大鼠血清中 IL-2含量（P<0.01），雷公藤阳性组能显著降低大鼠血清中 IL-2含量（P<0.05）。与空白组相比较，其它各组大鼠血清中IL-4的含量没有明显差异（P>0.05）。见表2。
2.4各组对大鼠关节滑膜组织病理形态的影响实验结果表明：镜下观察到空白组滑膜组织未见异常。模型组大鼠滑膜组织可见滑膜充血，滑膜增厚明顯，炎症细胞浸润，关节软骨破坏严重。阳性组大鼠可见滑膜细胞增生不明显，炎症细胞浸润明显减少。各双乌给药治疗组的滑膜充血、水肿均有不同程度减轻，淋巴细胞浸润明显减少，未见关节软骨破坏，与模型组比较均差异性显著，有统计学意义。病理学结果表明双乌组合给药能够明显改善AA大鼠关节的滑膜病变程度。结果见图2。
3讨论
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性多关节炎症为主要表现的全身性自身免疫性疾病，RA 在世界范围内的平均患病率约1%，我国的发病率为0.32%-0.36%，是一种致残率较高的疾病，严重影响患者的生活质量。西药受不良反应的限制较大，其毒副作用明显，患者难以长期耐受，中医药治疗此病具有独特优势，如副作用少、适宜长期服用等，使得中医药治疗此病成为近年来国内、外学者研究的主要方向[9]。
实验的体重测量结果反应出双乌组合给药具有安全性，不会对实验动物的体重以及消化系统等造成不良影响[10]。右后足足跖肿胀厚度测量结果表明，给药后各治疗组在21d和28d时体现出显著疗效，和膜型组比较有显著差异。大鼠血清细胞因子（TNF-α、IL-2、IL-4）检测结果表明，双乌中、高剂量组能显著降低大鼠血清中 TNF-ɑ及 IL-2含量，但对IL-4的含量没有明显影响。整个实验结果表明方剂治疗大鼠类风湿关节炎的机制主要与抑制炎性因子（IL-2、TNF-α）的产生与释放密切相关，而不是体现在保护或促进抑炎因子（IL-4）生成方面。
参考文献：
[1]孙琳，张杰.类风湿关节炎中西医治疗研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2013，15（4）：129-131.
[2]刘建磊，李宝丽.制附子对类风湿关节炎抗炎作用的实验研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（17）：184-186.
[3]吴湘慧，李娟，庞捷.类风湿关节炎大鼠模型的构建及昆明山海棠对大鼠佐剂性关节炎的干预研究[J].中药材，2009，32（5）：758-760.
[4]郭淑芳，杨彤.用鼠耳肿胀法研究抗炎药实验方法的改进[J].实验动物科学与管理，2003，20（3）：42-43.
[5]金桂芳，张文军，谭毓.鼻炎康片抗炎镇痛药效研究[J].中药材，2009，32（7）：1108-1111.
[6]陈刚，殷钟意，郑旭煦.柑橘皮总黄酮对大鼠佐剂性关节炎的影响及机制研究[J].中国中药杂志，2010，35（10）：1298-1300.[6]陈腊霞，王燕燕.中医药治疗类风湿性关节炎的研究进展[J].中国药房，2013，24（15）：1420-1422.
[7]张国恩，杨德华，钱玉中.痹康饮合剂对佐剂性关节炎大鼠的实验研究[J].北京中医药大学学报.2006，29（2）：104-106.
[8]高艳青，司银楚，牛欣.半夏泻心汤及其类方不同配伍对正常大鼠胃液成分的影响[J].北京中医药大学学报，2006，29（3）：168.
[9]吴斌，朱宁，张俊，等.99锝-亚甲基二磷酸盐对类风湿关节炎患者血清TNF-α和IL-6的影响[J].实用医学杂志，2012，28（2）：295-298.
[10]王振亮，姚乃礼.石藤胶囊对佐剂性关节炎大鼠 TNF-α，IL-1β的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（8）：195-197.
（收稿日期：2016-10-24）