了解并确定问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株LA2582和LA2901基因产物金属内肽酶活性及其致病相关性。
方法采用生物信息学软件分析LA2582和LA2901基因结构与功能。构建LA2582和LA2901基因胞外区原核表达系统，Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rLA2582和rLA2901。采用分光光度法检测rLA2582和rLA2901水解偶氮酪蛋白底物的活性。采用荧光分光光度法检测rLA2582和rLA2901水解Dabsyl-Leu-Gly-Gly-Gly-Ala-Edans荧光标记五肽底物的活性并测定其Km和Kcat值。采用SDS-PAGE和分光光度法分别检测rLA2582和rLA2901水解细胞外基质(ECM)分子Ⅰ型胶原蛋白(COL1)、纤维连接蛋白(FN)和刚果红标记弹性蛋白(ELN)的活性。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot法分别检测问号钩端螺旋体赖株感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后LA2582和LA2901基因mRNA和蛋白质表达水平。
结果LA2582和LA2901基因产物均为含信号肽和HXH基质金属蛋白酶基序的锌离子依赖M23家族Gly-Gly金属内肽酶。rLA2582和rLA2901不能水解偶氮酪蛋白，但能水解荧光五肽底物，其Km和Kcat值分别为126.54 μmol/L和4.67/s 、190.25 μmol/L和4.86/s 。rLA2582和rLA2901具有水解COL1、FN和ELN的活性。问号钩体赖株感染HUVEC后，LA2582和LA2901基因mRNA、蛋白质表达水平均显著升高(P<0.05)。
结论问号钩体赖株LA2582和LA2901基因产物是具有水解ECM分子活性的锌离子依赖M23金属内肽酶，与问号钩体侵袭力密切相关。