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摘 要：建立了同时测定食用菌中3种荧光增白剂（C.I.24，C.I. 210，C.I. 220）含量的高效液相色谱法。样品前处理采用50% N，N-二甲基甲酰胺-水溶液作提取剂，常温超声提取30 min。采用Sepax BR- C18柱为分析柱，以10 mmol·L-1甲酸铵水溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱，荧光激发波长为350 nm，发射波长为435 nm。结果显示，3种荧光增白剂在1～200 ng·mL-1浓度范围内相关系数均大于0.999，线性范围较宽，线性关系良好；C.I.24检出限为15 μg·kg-1，定量限为30.0 μg·kg-1，C.I.210和C.I.220检出限为7.5 μg·kg-1，定量限为15.0 μg·kg-1；3种荧光增白剂不同添加水平的加标平均回收率在75.1%～108.1%，RSD在1.2%～14.4%。该方法操作简便，结果准确，灵敏度高，重现性好，能够适用于食用菌中荧光增白剂的检测。
关键词：荧光增白剂；食用菌；高效液相色谱
中图分类号：O652.63 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.07.002
Study on Determination Method of Fluorescent Whitening Agents in Edible Fungi by HPLC
LEI Xinyu， FU Chengping， ZHONG Lingli， LI Xi， ZHAO Shan
（Analysis and Testing Center， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu， Sichuan 610066， China）
Abstract： A method for the determination of three kinds of fluorescent whitening agents（C.I.24， C.I. 210， C.I. 220）in edible fungi by HPLC was developed. The samples were extracted with 50% N， N-Dimethyl formamide-water solution by ultrasonic for 30 min at room temperature. The HPLC method was performed on a Sepax BR- C18 column， and 10 mmol·L-1 Ammonium formate and methanol were used as mobile phases in the gradient elution. Fluorescence detector was adopted in the excitation wavelength of 350 nm and emission wavelength of 435 nm. The results showed that the correlation coefficient of three kinds of fluorescent whitening agents in the range of concentration of 1 ～ 200 ng·mL-1 were greater than 0.999. The limit of detection of C.I.24 was 15 μg·kg-1， and the limit of quantification was 30.0 μg·kg-1， the limit of detection of C.I.210 and C.I.210 were 7.5 μg·kg-1， and the limit of quantification were 15.0 μg·kg-1. The average recoveries of three kinds of fluorescent whitening agents were in the range of 75.1%～108.1% at different spiked levels， and the RSD were in the range of 1.2%～14.4%. This method was simple， accurate， high sensitive and reproducible， and could be applied to the determination of fluorescent whitening agents in edible fungi.
Key word： fluorescent whitening agents； edible fungi； HPLC
熒光增白剂是一种荧光染料，它通过吸收不可见紫外光，再发射出可见蓝光或蓝紫色荧光，可使被染物品达到增白增艳的效果，被广泛应用于纺织、纸张、洗涤剂、包装等制造加工业[1]。除增白作用外，荧光增白剂还具有一定的防腐保鲜功能，因此市场上有不法商家将其添加到双孢菇、海鲜菇等白色食用菌中，以使产品色亮好看，货架期延长。另外，在包装、运输和销售过程中，食用菌与包装材料接触也可能导致荧光增白剂污染。有报道称，荧光增白剂被人体吸收后经长期积累会有致癌风险[2]。虽然现在荧光增白剂对人体的危害问题尚无定论，但基于目前的试验和研究水平，有必要对荧光增白剂的使用进行限制和监管。
在我国，荧光增白剂被划分为精细化工产品，严禁违法添加到农产品中。国家卫生标准也已明确规定，食品包装用原纸、餐具洗涤剂、食品工具设备用洗涤剂与洗涤消毒剂中均不得检出荧光性物质。为保障消费者的健康安全，在加强对食用菌中荧光增白剂污染问题监管力度的同时，研究和制定食用菌中荧光增白剂含量的测定方法有着重要的现实意义。目前，有关食用菌中荧光增白剂检测方法并无相关国家标准，现行的农业行业标准NY/T 1257—2006只能作定性检测，不能作定量检测，在一定程度上限制了食用菌安全监管效果。有关荧光增白剂检测方法的研究也主要集中在食品包装材料[3]、纸张[4]、洗涤剂[5]及塑料制品[6]等方面，关于食用菌的报道较少。有文献报道[7]，采用离子对试剂进行液相检测，能有效分离检测3种荧光增白剂，但离子对试剂的使用会造成色谱柱不可逆的损伤，缩短其使用寿命；另有报道[8]，采用液质联用法，结果准确、灵敏度高，但该法质谱设备成本高、操作技术要求高、固相萃取前处理步骤繁琐，方法推广有一定的局限性。 针对目前食用菌中荧光增白剂检测标准不完善及食用菌安全日常监管的需要，本文以市场上使用最多的二苯乙烯双三嗪结构型荧光增白剂为研究对象，前处理采用N，N-二甲基甲酰胺水溶液超声提取（较固相萃取法简便快捷，有效减少操作误差，降低实验成本），利用高效液相色谱-荧光检测法进行分析，获得快速、简便、灵敏度高的检测方法，旨在为食用菌中违禁添加荧光增白剂行为的监管工作提供有力的技术支持。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 食用菌 供试食用菌为市售的新鲜双孢菇、海鲜菇、鸡腿菇、白玉菇。
1.1.2 试剂与仪器设备 甲醇为色谱纯，美国Fisher公司；乙腈为色谱纯，美国Fisher公司；甲酸铵为色谱纯，美国Sigma公司；N，N-二甲基甲酰胺为分析纯，西陇化工；氨水为分析纯，浓度为25%～28%，西陇化工。荧光增白剂标准品（C.I.24，C.I. 210，C.I. 220）为100 μg·mL-1，福州绿川生物科技有限公司。
Agilent 1200高效液相色谱仪（配置荧光检测器），美国Agilent公司；AUY220型分析天平，日本岛津公司；TDZ5-WS离心机，长沙湘仪仪器有限公司；QIlinbeier涡旋混匀器， 海门市其林贝尔仪器制造有限公司； KQ5200DE超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司。
1.1.3 高效液相色谱条件 色譜柱为Sepax BR- C18柱（250.0 mm×4.6 mm，粒径5 μm，pH值适用范围2～10）；流动相A相为10 mmol·L-1甲酸铵水溶液；B相为甲醇；流速为0.8 mL·min-1；柱温为40 ℃；进样量为10 μL；激发波长为350 nm；发射波长为435 nm；梯度洗脱条件如表1所示。
1.2 方 法
1.2.1 标准溶液的配制
1.2.1.1 标准储备液（10 μg·mL-1） 精密移取适量荧光增白剂C.I.24、C.I. 210、C.I. 220标准品，用40%乙腈水溶液分别配制成浓度为10 μg·mL-1的储备液，避光1～5 ℃保存，有效期90 d。
1.2.1.2 混合标准储备液（C.I.24为2.0 μg·mL-1，C.I.210和C.I.220为1.0 μg·mL-1）分别移取2 mL C.I.24、1 mL C.I.210、1 mL C.I.220的上述3种标准储备液，用40%乙腈水定容至10 mL，避光1～5 ℃保存，有效期30 d。
1.2.1.3 混合标准工作液 根据需要吸取适量混合标准储备液，用40% N，N-二甲基甲酰胺-水溶液稀释至一定浓度（含C.I.24浓度为2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 ng·mL-1，C.I.210和C.I.220浓度为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0， 50.0，100.0 ng·mL-1的系列标准溶液）。避光1～5 ℃保存，有效期7 d。
1.2.2 样品前处理 称取5 g试样匀浆（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入30 mL的 50% N，N-二甲基甲酰胺-水溶液涡旋混匀后，用氨水调节pH值至8，超声30 min，在4 000 r·min-1下离心10 min。取1 mL上清液加0.25 mL水涡旋混匀，经0.22 μm有机滤膜过滤至棕色进样瓶，备用。
2 结果与分析
2.1 液相条件的确定
2.1.1 流动相的选择 本试验首先比较了液相中最常用的乙腈-水和甲醇-水2种流动相系统对3种荧光增白剂的分离效果，结果发现，其分离效果和色谱峰峰形均不好，由于乙腈洗脱能力更强，目标物几乎无保留。考虑到这3种荧光增白剂均属于含有磺酸基的二苯乙烯双三嗪结构的阴离子型化合物，在酸性条件下不稳定，容易发生聚合和析出[8]，试验采用甲酸铵水溶液和甲醇作为流动相，考察了不同浓度的缓冲液和不同梯度条件下的分离效果，结果表明，以10 mmol·L-1甲酸铵水溶液和甲醇作为流动相，按表1所述洗脱条件进行梯度洗脱可获得满意的信号响应和分离效果。
2.1.2 色谱柱的选择 在相同色谱条件下，对比了CLOVERSIL C18 柱和Sepax BR- C18柱的分离效果，结果表明，二者均有很好的保留。但考虑到试验条件偏碱性，为减小对色谱柱的伤害，延长色谱柱的寿命，试验选用耐碱性更好的Sepax BR- C18柱（250.0 mm×4.6 mm，粒径5 μm，pH值适用范围2～10）。3种荧光增白剂混合标液的色谱如图1所示。
2.2 前处理条件的确定
2.2.1 提取溶剂的选择 在查阅相关文献的基础上[9-10]，初步选用乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、三氯甲烷作为提取溶剂，选用双孢菇阴性样品加标进行回收试验，结果表明，N，N-二甲基甲酰胺提取效果最好，其次为二甲亚砜，乙腈、甲醇几乎无回收，因此，选择N，N-二甲基甲酰胺作为提取溶剂。进一步对提取溶剂的浓度进行筛选，分别以20%，40%，50%，80%，100%的N，N-二甲基甲酰胺-水溶液为提取液，比较不同浓度N，N-二甲基甲酰胺溶液的提取效果，结果如图2所示。随着N，N-二甲基甲酰胺浓度的增加，提取回收率呈增加趋势，当浓度达到50%以上后，回收率基本保持不变，考虑到高浓度的有机试剂对环境的污染和对实验人员健康的不利，在保证提取效果的前提下，选用50%的N，N-二甲基甲酰胺作为提取溶剂。
2.2.2 溶剂效应的消除 当样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时，有可能出现目标峰展宽、分叉的现象，即溶剂效应。本方法中样品提取溶剂为50%的N，N-二甲基甲酰胺，极性大于初始流动相，直接进样检测后发现，色谱峰变宽且出现分叉，严重影响了方法的准确度和灵敏度。为消除溶剂效应的影响，采用稀释样品溶剂浓度的方法改善峰形。经试验发现，当N，N-二甲基甲酰胺浓度不大于40%时，不再出现溶剂效应。考虑到过度稀释样品液会降低方法灵敏度，在避免溶剂效应的前提下，选择将样品上机液浓度稀释至40%。 2.2.3 提取液pH值的确定 分别用盐酸和氨水调节提取液pH值至4，6，8，10，以未调pH值提取液为对照，选用双孢菇阴性样品加标进行回收试验，比较不同pH值提取液对荧光增白剂提取效果的影响，结果表明（图3），提取液pH值对回收率有显著影响，其中，偏酸性提取液和对照组基本无回收；偏碱性提取液回收率显著增加，当提取液pH值为8时回收率最高。因此，提取液pH值确定为8。
2.2.4 提取液用量的确定 分别考察了不同提取溶剂体积（15，20，25，30，40 mL）对双孢菇加标样品中3种荧光增白剂的提取效果，结果表明（图4），增加提取溶剂体积有助于提升提取效果，当提取体积为30，40 mL时，3种荧光增白剂的回收率均较高，且二者间无显著差异。为节省溶剂成本，减少环境污染，同时考虑到提取液用量增加会降低方法灵敏度，故选取提取溶剂体积为30 mL。
2.2.5 提取温度和提取时间的确定 将双孢菇加标样品分别于室温、40，50，60，70 ℃条件下超声提取30 min，比较提取温度对荧光增白剂提取效果的影响，结果表明（图5），各个温度下荧光增白剂的回收率间无显著差异，说明提取效果几乎不受温度的影响。因此，选择在常温条件下提取。将加标样品分别超声提取15，30，60，120 min，比较超声时间对提取效果的影响，结果表明，回收率在较短时间段内增加明显，在30 min时提取回收率最高；随着提取时间继续延长，提取回收率稍有下降（图6），故选择提取时间为30 min。
2.3 方法学考察
2.3.1 方法的线性范围、检出限与定量限 将系列混合标准工作液由低到高依次进样检测，以测得峰面积为纵坐标，以对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数，结果表明，荧光增白剂标准工作液在1～200 ng·mL-1范围内相关系数均大于0.999，线性范围较宽，线性关系良好。根据信噪比（S/N）>3为检出限，信噪比（S/N）>10为定量限的原则，再根据前处理中稀释倍数的换算，得出方法检出限和方法定量限，结果如表2所示。
2.3.2 方法的回收率与精密度 对双孢菇、海鲜菇、鸡腿菇和白玉菇4种白色食用菌进行空白加标回收试验。在空白样品中添加适量荧光增白剂标准工作液，分别制成检出限、5倍定量限和25倍定量限3个浓度水平的阳性样品，每一水平进行6次平行测定，平均回收率与精密度如表3所示。由表3可知，3种荧光增白剂不同添加水平的平均回收率在75.1%～108.1%，RSD在1.2%～14.4%，其回收率和精密度均符合方法学要求，可用于食用菌中荧光增白剂C.I.24、C.I.210、C.I.220的检测。
2.3.3 空白试验 为确认样品基质对目标分析物是否存在干扰现象，将食用菌阴性试样按本方法进行测定分析，结果表明，在目标分析物出峰位置没有其他杂质峰出现，即样品基质对所测分析物无干扰，试验方法能满足检测要求。图7、图8分别为双孢菇空白样与加标样的液相色谱结果。
3 结 论
本研究采用高效液相色谱-荧光检测法建立了食用菌中3种荧光增白剂含量的检测方法。该方法前处理简便高效，方法线性范围宽，线性关系良好，灵敏准确，精密度高，有效填补了目前食用菌中荧光增白剂检测标准的技术空白，为维护消费者的身体健康和保障农产品质量安全监管工作提供了技术手段。
参考文献：
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[2]佘集锋.浅谈食品包装用纸中有毒有害物质的来源及其危害[J]. 湖北造纸， 2007（2）： 36-38.
[3]焦艳娜，丁利，朱绍华， 等. 高效液相色谱-荧光检测法测定食品接触材料塑料制品中荧光增白剂[J].色谱， 2013（1）： 83-87.
[4]张舒心， 柴欣生， 田迎新， 等. 一种测定纸制品中可迁移性荧光增白剂含量的双波长紫外光谱方法[J].光谱学与光谱分析， 2015（7）： 1921-1925.
[5]马会娟， 马强， 白桦， 等. 洗涤用品中5种荧光增白剂的高效液相色谱法检测及质谱确证[J].分析实验室， 2014（5）： 569-573.
[6]薄海波，星玉秀，吉生军，等. 固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定酸奶中55种塑料添加剂[J].食品科学， 2017（24）： 265-271.
[7]练习中， 陈梅斯， 郑丽斯， 等. 高效液相色谱法测定食品中荧光增白剂[J]. 現代食品科技， 2011（10）： 1281-1284.
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关键词：荧光增白剂；食用菌；高效液相色谱
中图分类号：O652.63 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.07.002
Study on Determination Method of Fluorescent Whitening Agents in Edible Fungi by HPLC
LEI Xinyu， FU Chengping， ZHONG Lingli， LI Xi， ZHAO Shan
（Analysis and Testing Center， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu， Sichuan 610066， China）
Abstract： A method for the determination of three kinds of fluorescent whitening agents（C.I.24， C.I. 210， C.I. 220）in edible fungi by HPLC was developed. The samples were extracted with 50% N， N-Dimethyl formamide-water solution by ultrasonic for 30 min at room temperature. The HPLC method was performed on a Sepax BR- C18 column， and 10 mmol·L-1 Ammonium formate and methanol were used as mobile phases in the gradient elution. Fluorescence detector was adopted in the excitation wavelength of 350 nm and emission wavelength of 435 nm. The results showed that the correlation coefficient of three kinds of fluorescent whitening agents in the range of concentration of 1 ～ 200 ng·mL-1 were greater than 0.999. The limit of detection of C.I.24 was 15 μg·kg-1， and the limit of quantification was 30.0 μg·kg-1， the limit of detection of C.I.210 and C.I.210 were 7.5 μg·kg-1， and the limit of quantification were 15.0 μg·kg-1. The average recoveries of three kinds of fluorescent whitening agents were in the range of 75.1%～108.1% at different spiked levels， and the RSD were in the range of 1.2%～14.4%. This method was simple， accurate， high sensitive and reproducible， and could be applied to the determination of fluorescent whitening agents in edible fungi.
Key word： fluorescent whitening agents； edible fungi； HPLC
熒光增白剂是一种荧光染料，它通过吸收不可见紫外光，再发射出可见蓝光或蓝紫色荧光，可使被染物品达到增白增艳的效果，被广泛应用于纺织、纸张、洗涤剂、包装等制造加工业[1]。除增白作用外，荧光增白剂还具有一定的防腐保鲜功能，因此市场上有不法商家将其添加到双孢菇、海鲜菇等白色食用菌中，以使产品色亮好看，货架期延长。另外，在包装、运输和销售过程中，食用菌与包装材料接触也可能导致荧光增白剂污染。有报道称，荧光增白剂被人体吸收后经长期积累会有致癌风险[2]。虽然现在荧光增白剂对人体的危害问题尚无定论，但基于目前的试验和研究水平，有必要对荧光增白剂的使用进行限制和监管。
在我国，荧光增白剂被划分为精细化工产品，严禁违法添加到农产品中。国家卫生标准也已明确规定，食品包装用原纸、餐具洗涤剂、食品工具设备用洗涤剂与洗涤消毒剂中均不得检出荧光性物质。为保障消费者的健康安全，在加强对食用菌中荧光增白剂污染问题监管力度的同时，研究和制定食用菌中荧光增白剂含量的测定方法有着重要的现实意义。目前，有关食用菌中荧光增白剂检测方法并无相关国家标准，现行的农业行业标准NY/T 1257—2006只能作定性检测，不能作定量检测，在一定程度上限制了食用菌安全监管效果。有关荧光增白剂检测方法的研究也主要集中在食品包装材料[3]、纸张[4]、洗涤剂[5]及塑料制品[6]等方面，关于食用菌的报道较少。有文献报道[7]，采用离子对试剂进行液相检测，能有效分离检测3种荧光增白剂，但离子对试剂的使用会造成色谱柱不可逆的损伤，缩短其使用寿命；另有报道[8]，采用液质联用法，结果准确、灵敏度高，但该法质谱设备成本高、操作技术要求高、固相萃取前处理步骤繁琐，方法推广有一定的局限性。 针对目前食用菌中荧光增白剂检测标准不完善及食用菌安全日常监管的需要，本文以市场上使用最多的二苯乙烯双三嗪结构型荧光增白剂为研究对象，前处理采用N，N-二甲基甲酰胺水溶液超声提取（较固相萃取法简便快捷，有效减少操作误差，降低实验成本），利用高效液相色谱-荧光检测法进行分析，获得快速、简便、灵敏度高的检测方法，旨在为食用菌中违禁添加荧光增白剂行为的监管工作提供有力的技术支持。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 食用菌 供试食用菌为市售的新鲜双孢菇、海鲜菇、鸡腿菇、白玉菇。
1.1.2 试剂与仪器设备 甲醇为色谱纯，美国Fisher公司；乙腈为色谱纯，美国Fisher公司；甲酸铵为色谱纯，美国Sigma公司；N，N-二甲基甲酰胺为分析纯，西陇化工；氨水为分析纯，浓度为25%～28%，西陇化工。荧光增白剂标准品（C.I.24，C.I. 210，C.I. 220）为100 μg·mL-1，福州绿川生物科技有限公司。
Agilent 1200高效液相色谱仪（配置荧光检测器），美国Agilent公司；AUY220型分析天平，日本岛津公司；TDZ5-WS离心机，长沙湘仪仪器有限公司；QIlinbeier涡旋混匀器， 海门市其林贝尔仪器制造有限公司； KQ5200DE超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司。
1.1.3 高效液相色谱条件 色譜柱为Sepax BR- C18柱（250.0 mm×4.6 mm，粒径5 μm，pH值适用范围2～10）；流动相A相为10 mmol·L-1甲酸铵水溶液；B相为甲醇；流速为0.8 mL·min-1；柱温为40 ℃；进样量为10 μL；激发波长为350 nm；发射波长为435 nm；梯度洗脱条件如表1所示。
1.2 方 法
1.2.1 标准溶液的配制
1.2.1.1 标准储备液（10 μg·mL-1） 精密移取适量荧光增白剂C.I.24、C.I. 210、C.I. 220标准品，用40%乙腈水溶液分别配制成浓度为10 μg·mL-1的储备液，避光1～5 ℃保存，有效期90 d。
1.2.1.2 混合标准储备液（C.I.24为2.0 μg·mL-1，C.I.210和C.I.220为1.0 μg·mL-1）分别移取2 mL C.I.24、1 mL C.I.210、1 mL C.I.220的上述3种标准储备液，用40%乙腈水定容至10 mL，避光1～5 ℃保存，有效期30 d。
1.2.1.3 混合标准工作液 根据需要吸取适量混合标准储备液，用40% N，N-二甲基甲酰胺-水溶液稀释至一定浓度（含C.I.24浓度为2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 ng·mL-1，C.I.210和C.I.220浓度为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0， 50.0，100.0 ng·mL-1的系列标准溶液）。避光1～5 ℃保存，有效期7 d。
1.2.2 样品前处理 称取5 g试样匀浆（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入30 mL的 50% N，N-二甲基甲酰胺-水溶液涡旋混匀后，用氨水调节pH值至8，超声30 min，在4 000 r·min-1下离心10 min。取1 mL上清液加0.25 mL水涡旋混匀，经0.22 μm有机滤膜过滤至棕色进样瓶，备用。
2 结果与分析
2.1 液相条件的确定
2.1.1 流动相的选择 本试验首先比较了液相中最常用的乙腈-水和甲醇-水2种流动相系统对3种荧光增白剂的分离效果，结果发现，其分离效果和色谱峰峰形均不好，由于乙腈洗脱能力更强，目标物几乎无保留。考虑到这3种荧光增白剂均属于含有磺酸基的二苯乙烯双三嗪结构的阴离子型化合物，在酸性条件下不稳定，容易发生聚合和析出[8]，试验采用甲酸铵水溶液和甲醇作为流动相，考察了不同浓度的缓冲液和不同梯度条件下的分离效果，结果表明，以10 mmol·L-1甲酸铵水溶液和甲醇作为流动相，按表1所述洗脱条件进行梯度洗脱可获得满意的信号响应和分离效果。
2.1.2 色谱柱的选择 在相同色谱条件下，对比了CLOVERSIL C18 柱和Sepax BR- C18柱的分离效果，结果表明，二者均有很好的保留。但考虑到试验条件偏碱性，为减小对色谱柱的伤害，延长色谱柱的寿命，试验选用耐碱性更好的Sepax BR- C18柱（250.0 mm×4.6 mm，粒径5 μm，pH值适用范围2～10）。3种荧光增白剂混合标液的色谱如图1所示。
2.2 前处理条件的确定
2.2.1 提取溶剂的选择 在查阅相关文献的基础上[9-10]，初步选用乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、三氯甲烷作为提取溶剂，选用双孢菇阴性样品加标进行回收试验，结果表明，N，N-二甲基甲酰胺提取效果最好，其次为二甲亚砜，乙腈、甲醇几乎无回收，因此，选择N，N-二甲基甲酰胺作为提取溶剂。进一步对提取溶剂的浓度进行筛选，分别以20%，40%，50%，80%，100%的N，N-二甲基甲酰胺-水溶液为提取液，比较不同浓度N，N-二甲基甲酰胺溶液的提取效果，结果如图2所示。随着N，N-二甲基甲酰胺浓度的增加，提取回收率呈增加趋势，当浓度达到50%以上后，回收率基本保持不变，考虑到高浓度的有机试剂对环境的污染和对实验人员健康的不利，在保证提取效果的前提下，选用50%的N，N-二甲基甲酰胺作为提取溶剂。
2.2.2 溶剂效应的消除 当样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时，有可能出现目标峰展宽、分叉的现象，即溶剂效应。本方法中样品提取溶剂为50%的N，N-二甲基甲酰胺，极性大于初始流动相，直接进样检测后发现，色谱峰变宽且出现分叉，严重影响了方法的准确度和灵敏度。为消除溶剂效应的影响，采用稀释样品溶剂浓度的方法改善峰形。经试验发现，当N，N-二甲基甲酰胺浓度不大于40%时，不再出现溶剂效应。考虑到过度稀释样品液会降低方法灵敏度，在避免溶剂效应的前提下，选择将样品上机液浓度稀释至40%。 2.2.3 提取液pH值的确定 分别用盐酸和氨水调节提取液pH值至4，6，8，10，以未调pH值提取液为对照，选用双孢菇阴性样品加标进行回收试验，比较不同pH值提取液对荧光增白剂提取效果的影响，结果表明（图3），提取液pH值对回收率有显著影响，其中，偏酸性提取液和对照组基本无回收；偏碱性提取液回收率显著增加，当提取液pH值为8时回收率最高。因此，提取液pH值确定为8。
2.2.4 提取液用量的确定 分别考察了不同提取溶剂体积（15，20，25，30，40 mL）对双孢菇加标样品中3种荧光增白剂的提取效果，结果表明（图4），增加提取溶剂体积有助于提升提取效果，当提取体积为30，40 mL时，3种荧光增白剂的回收率均较高，且二者间无显著差异。为节省溶剂成本，减少环境污染，同时考虑到提取液用量增加会降低方法灵敏度，故选取提取溶剂体积为30 mL。
2.2.5 提取温度和提取时间的确定 将双孢菇加标样品分别于室温、40，50，60，70 ℃条件下超声提取30 min，比较提取温度对荧光增白剂提取效果的影响，结果表明（图5），各个温度下荧光增白剂的回收率间无显著差异，说明提取效果几乎不受温度的影响。因此，选择在常温条件下提取。将加标样品分别超声提取15，30，60，120 min，比较超声时间对提取效果的影响，结果表明，回收率在较短时间段内增加明显，在30 min时提取回收率最高；随着提取时间继续延长，提取回收率稍有下降（图6），故选择提取时间为30 min。
2.3 方法学考察
2.3.1 方法的线性范围、检出限与定量限 将系列混合标准工作液由低到高依次进样检测，以测得峰面积为纵坐标，以对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数，结果表明，荧光增白剂标准工作液在1～200 ng·mL-1范围内相关系数均大于0.999，线性范围较宽，线性关系良好。根据信噪比（S/N）>3为检出限，信噪比（S/N）>10为定量限的原则，再根据前处理中稀释倍数的换算，得出方法检出限和方法定量限，结果如表2所示。
2.3.2 方法的回收率与精密度 对双孢菇、海鲜菇、鸡腿菇和白玉菇4种白色食用菌进行空白加标回收试验。在空白样品中添加适量荧光增白剂标准工作液，分别制成检出限、5倍定量限和25倍定量限3个浓度水平的阳性样品，每一水平进行6次平行测定，平均回收率与精密度如表3所示。由表3可知，3种荧光增白剂不同添加水平的平均回收率在75.1%～108.1%，RSD在1.2%～14.4%，其回收率和精密度均符合方法学要求，可用于食用菌中荧光增白剂C.I.24、C.I.210、C.I.220的检测。
2.3.3 空白试验 为确认样品基质对目标分析物是否存在干扰现象，将食用菌阴性试样按本方法进行测定分析，结果表明，在目标分析物出峰位置没有其他杂质峰出现，即样品基质对所测分析物无干扰，试验方法能满足检测要求。图7、图8分别为双孢菇空白样与加标样的液相色谱结果。
3 结 论
本研究采用高效液相色谱-荧光检测法建立了食用菌中3种荧光增白剂含量的检测方法。该方法前处理简便高效，方法线性范围宽，线性关系良好，灵敏准确，精密度高，有效填补了目前食用菌中荧光增白剂检测标准的技术空白，为维护消费者的身体健康和保障农产品质量安全监管工作提供了技术手段。
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