【摘 要】
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【目的】热应激严重影响奶牛的生产和健康，是制约奶业持续健康发展的重要因素。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制参与动物的热应激反应，但其在奶牛热应激过程中的作用和分子机制研究较少。研究通过检测奶牛热应激相关的DNA甲基化变化，筛选和验证DNA甲基化相关的关键基因，为奶牛热应激的表观遗传机制研究积累数据。【方法】以北京市三元绿荷金银岛牧场的24头中国荷斯坦牛（泌乳阶段及胎次相同）为研究对象，分
【基金项目】
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国家自然科学基金外国青年学者研究基金（3175011045）； 财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系（CARS-36）；
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【目的】热应激严重影响奶牛的生产和健康，是制约奶业持续健康发展的重要因素。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制参与动物的热应激反应，但其在奶牛热应激过程中的作用和分子机制研究较少。研究通过检测奶牛热应激相关的DNA甲基化变化，筛选和验证DNA甲基化相关的关键基因，为奶牛热应激的表观遗传机制研究积累数据。【方法】以北京市三元绿荷金银岛牧场的24头中国荷斯坦牛（泌乳阶段及胎次相同）为研究对象，分别于春季（非应激期，2017年4月份）和夏季（热应激期，2017年7月份）采集试验个体的血液，提取DNA，共获得48份DNA样本。首先，随机选择其中15头奶牛，并随机分为3组，每组5份DNA样本混合，通过全基因组重亚硫酸盐测序法（Whole-genome bisulfite sequencing, WGBS）检测奶牛基因组DNA的甲基化状态，筛选差异甲基化区域（Differential methylation region, DMR; 1000 bp windows, 500 bp overlap, P＜0.05）及相关基因，利用PROMO和Methprimer软件预测基因启动子的转录因子结合位点和CpG岛区。然后，39℃热处理牛乳腺上皮细胞（Bovine mammary gland epithelial cells, Mac-T）不同时间（24 h, 48 h, 72 h）,MTT法检测细胞活力。最后，利用亚硫酸盐测序法（Bisulfite sequencing PCR, BSP）分别对春夏季的24头奶牛及39℃热处理不同时间的Mac-T细胞中目的基因启动子区的甲基化状态进行分析。【结果】通过WGBS共得到49 861个DMRs，其中一个DMR注释到基因GNAS复合体基因座（GNAS complex locus, GNAS）的启动子区，其整体甲基化水平在夏季热应激期极显著上调（P＜0.001），且该区域预测到一个352 bp的CpG岛，包含Sp1、C/EBP等重要转录因子的结合区域。24头奶牛个体中GNAS启动子区31个CG位点的整体甲基化水平在热应激期显著上调（P＜0.05），与WGBS结果一致，其中，21号（-113 bp,Chr13:57532733）和27号CG （-63bp,Chr13:57532683）位点甲基化水平显著上调（P＜0.05）。Mac-T细胞热处理48和72 h后，细胞活力极显著下降（P＜0.01）,GNAS启动子的CG位点整体甲基化水平显著上调（P＜0.05）,21号和27号CG均为显著上调的差异甲基化位点，与个体水平结果一致。【结论】热应激会引起奶牛GNAS启动子甲基化水平增加，GNAS是奶牛热应激DNA甲基化调控的潜在靶基因。
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