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摘 要 肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤类型，早期诊断对改善肺癌患者的预后至关重要。肺癌的发生是多因素、多基因参与的复杂过程。近年来，生物标志物的异常表达已成为肺癌早期诊断研究中的热点。随着检测技术的快速发展，肺癌自身抗体、循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞、微小RNA等生物标志物不断被发现。本文就生物标志物用于肺癌早期诊断的研究进展作一概要介绍。
关键词 肺癌 早期诊断 生物标志物
中图分类号：R734.2 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）07-0003-03
Advances in application of biomarkers in early diagnosis of lung cancer
ZHANG Longfu1，2*， ZHANG Xin1**（1. Department of Pulmonary Medicine， Zhongshan Hospital， Fudan University， Shanghai 200032， China； 2. Department of Pulmonary Medicine， Central Hospital of Xuhui District， Shanghai 200031， China）
ABSTRACT Lung cancer is the type of malignancy with the highest morbidity and mortality worldwide. Early diagnosis is of great significance for improving the prognosis of lung cancer. The occurrence of lung cancer is a complex process involving in multiple factors and multiple genes. In recent years， the abnormal expression of biomarkers has become a hot spot in the research of early diagnosis of lung cancer and some new biomarkers， such as autoantibodies， circulating tumor DNA， circulating tumor cells， and microRNA have been emerging with the rapid development of detection technology. The research progress in this field is briefly introduced in this article.
KEy WORDS lung cancer； early diagnosis； biomarkers
肺癌是全球范圍内最常见的恶性肿瘤类型，其发病率和死亡率在各类恶性肿瘤中均居首位，且发病率和死亡率仍在上升[1]。早期肺癌缺乏特异性表现，故大部分肺癌诊出时已处于中、晚期，失去了根治的机会，只能采用化疗、靶向治疗为主的综合治疗，患者的5年生存率<15%[2]。如果临床上能够早期诊断肺癌，即可显著改善患者的预后。研究显示，Ⅰ期肺癌患者术后的5年生存率高达90%[3]。由此可见，肺癌的早期诊断具有重要的临床意义。
目前已见有以胸部低剂量螺旋CT、支气管内镜、痰脱落细胞等作为筛查方法进行早期肺癌诊断的多项研究报告，但这些方法的敏感度、特异度和适用性等均存在一定的局限性。随着分子生物学理论的快速发展、相关检测方法的不断改进，分子诊断已成为肿瘤病理学研究的主要内容和手段。近年来，国内外学者对生物标志物用于肺癌早期诊断进行了大量研究，本文就其研究进展作一概要介绍。
1 血清蛋白标志物
1.1 血清肿瘤标志物
血清肿瘤标志物检测具有无创、快捷、简便等优点，成为肺癌筛查及其辅助诊断的主要手段。现阶段临床上常用的血清肺癌标志物包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolization enzyme， NSE）、鳞状上皮细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen， SCC）、细胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment， CYFRA21-1）、前胃泌素释放肽（pro-gastrin-releasing peptide， pro-GRP）等，但这些标志物单独用于肺癌早期诊断的敏感度和特异度均不高[4-7]，如癌胚抗原水平用于肺癌诊断的敏感度只有33.3% ～ 52%[5-6]。NSE和pro-GRP水平异常主要见于小细胞肺癌患者，癌胚抗原、SCC和CYRFA21-1水平异常主要见于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）患者。这些标志物的水平在不同个体间的差异较大，在同一个体中则与肿瘤负荷有一定的相关性。
为提高诊断的敏感度，多项研究探讨了多种标志物联合检测的应用价值，结果显示癌胚抗原、NSE、SCC、CYFRA21-1的三联或四联检测用于肺癌筛查的敏感度可达80% ～ 90%，特异度>70%[5-7]，显著优于这些标志物单独检测的结果。这些标志物水平异常也见于其他恶性肿瘤类型。不过，由于早期肺癌的肿瘤负荷较小，这些标志物的敏感度还是太低，特别是在肺毛玻璃结节的鉴别上，这些标志物几乎没有鉴别诊断价值。
1.2 肺癌自身抗体
在肺癌发生的早期，机体的免疫系统能识别肿瘤细胞表面的特异性抗原，然后分泌针对这些抗原的自身抗体。肺癌自身抗体在肺癌早期即出现，故可用于肺癌早期筛查[8]。然而，单独检测肺癌自身抗体用于肺癌筛查同样存在敏感度和特异度不理想的问题，而联合检测多种肺癌自身抗体可弥补这一缺陷。上海市肺科医院组织进行的一项多中心研究探讨了7种肺癌自身抗体（GAGE7、CAGE、MAGE A1、SOX2、GBU4-5、p53、PGP9.5）检测在肺癌早期诊断中的应用价值，结果显示联合检测这7种肺癌自身抗体用于肺癌筛查的敏感度和特异度分别达61.0%和90.0%，其中用于Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC诊断的敏感度分别为62%和59%，用于局限期小细胞肺癌诊断的敏感度为59%[9]。 2 循环肿瘤DNA
循环肿瘤DNA是指血液循环中的肿瘤细胞凋亡后产生的双链或单链DNA片段，其基因改变与肿瘤组织的一致。随着分子生物学技术的快速发展，如第二代基因测序技术、数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）等技术的出现，循环肿瘤DNA的检测灵敏度已大大提高，具有用于肿瘤早期诊断的潜力。肿瘤细胞在血流中凋亡后，血浆中来自不同染色体的循环肿瘤DNA片段数量与染色体拷贝数成正比，通过第二代测序技术捕获测序1 000万个DNA片段，其相应染色体的数量变化就有了统计学意义，从而可用来判断体内的肿瘤负荷和肿瘤类型[10-11]。此外，肿瘤细胞DNA携带的倒序、点突变信息也可通过测序获得[12]。
Newman等[13]在采用癌症个体化深度测序方法检测循环肿瘤DNA的研究中发现，循环肿瘤DNA检测用于肺癌诊断的敏感度在Ⅱ～ Ⅳ期和Ⅰ期NSCLC患者中分别为100.0%和50.0%，特异度均为96.0%，且循环肿瘤DNA的表达量与肿瘤大小相关，相关系数为0.89。该研究表明，采用高通量的第二代测序技术检测循环肿瘤DNA中的基因变异有助于NSCLC的早期诊断。不过，由于循环肿瘤DNA的含量较低，在早期肺癌患者中的含量更低，因此欲更好地发挥循环肿瘤DNA检测在肺癌早期诊断中的应用价值，还需不断改进检测技术、DNA抽提技术并建立多基因检测谱。
3 循环微小RNA（microRNA， miRNA）
miRNA是一类高度保守的小分子RNA，是长度为19 ～ 25个核苷酸的内源性非编码调控RNA，可通过靶向结合mRNA的3′-非翻译區而致mRNA降解或翻译受到抑制，从而实现对靶基因表达的调控。miRNA在不同组织中的表达谱不同，在肺癌与正常组织之间以及不同的肺癌组织之间的表达谱也不相同，故其检测有用于肺癌诊断的潜力。
Geng等[14]的研究发现，NSCLC患者和健康人群的循环miRNA（miRNA-20a、miRNA-145、miRNA-21、miRNA-223、miRNA-221）的表达有显著差异，故miRNA可用作早期NSCLC诊断的肿瘤标志物。Hennessey等[15]采用实时定量PCR技术检测了30例NSCLC患者和20名健康者血清中180种miRNA的表达，结果发现miR-15b和miR-27b的检测有助于NSCLC诊断，miR-15b和miR-27b检测用于NSCLC诊断的敏感度和特异度分别达100%和84%。多种miRNA的联合检测有助于提高肺癌早期诊断的敏感度和特异度。
4 循环肿瘤细胞（circulating tumor cell， CTC）
CTC是指进入了血液循环的肿瘤细胞，它们在肿瘤进展和转移中起着关键作用。由于在早期肿瘤、甚至癌前病变的患者外周血中即已存在CTC，故如能检测CTC，就可用于肿瘤早期诊断。
上海市肺科医院、上海市胸科医院和中国医学科学院肿瘤医院联合进行了一项多中心研究，采用靶向PCR技术检测了560例肺癌患者、350例肺良性肿瘤患者、150名健康者和150例非肺源性恶性肿瘤患者的CTC，结果发现CTC检测用于肺癌辅助诊断的价值显著高于血清肿瘤标志物，敏感度和特异度分别达79.6%和88.2%，其中对Ⅰ期（早期）肺癌诊断的敏感度达67.2%[16]。
5 呼出气中的有机化合物（volatile organic compounds， VOC）
VOC检测具有快速、无创、便捷、灵敏度高和可重复性好等优点，是一种潜在的新型肿瘤诊断方法。多项研究结果表明，VOC的组成及其浓度可以反映肺癌的疾病状况，建立和开发其数据库及预测模型对肺癌早期诊断具有重要的应用价值[17-18]。陈璐等[17]采用电子鼻检测了63例肺癌患者和72名健康者的VOC并予以比较，建立了肺癌预测模型，后者用于肺癌诊断的敏感度达74.0%，特异度达93.0%。
下呼吸道表面产生的代谢产物会以气溶胶形态存在于呼出气中，呼出气被引入冷凝系统后转化为液体或雪状物，即呼出气体冷凝物（exhaled breath condensate， EBC）。多项研究结果提示，通过检测EBC中的肿瘤相关基因（主要包括p53、p16、Bcl-2、K-ras等）以及微卫星改变、细胞因子、氧化应激产物等可实现肺癌的早期诊断[19-22]。有关研究发现，在33% ～ 70%的肺腺癌患者EBC中可检出p53突变[19]，在53%的肺癌患者EBC中可发现微卫星改变[20]。
6 结语
综上所述，肺癌的早期诊断是改善肺癌患者预后的关键，因此人们一直在开发肺癌早期诊断新技术。肺癌早期诊断技术除须有高敏感度和特异度外，还应具有创伤小、操作简单、成本低廉等特点。近年来，新的肿瘤相关生物标志物不断被发现，它们的检测和应用相对方便，而联合检测有助于提高肺癌诊断的敏感度和特异度，特别是血清肿瘤标志物、肺癌自身抗体和miRNA等联合检测的应用价值已进入临床研究阶段，有望成为肺癌早期诊断和筛查的有效手段。当然，在生物标志物用于肺癌早期诊断方面也存在不少问题，如较多新的肿瘤相关生物标志物的检测技术尚不成熟，检测成本很高；这些生物标志物检测用于临床实践的证据不足等。因此，临床上应进行更深入的研究或验证工作，同时更深入地了解从癌前病变至肺癌发生的动态过程，在此基础上不断研究和开发新的技术和方法，使肺癌早期诊断技术日臻完善。
参考文献
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关键词 肺癌 早期诊断 生物标志物
中图分类号：R734.2 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）07-0003-03
Advances in application of biomarkers in early diagnosis of lung cancer
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KEy WORDS lung cancer； early diagnosis； biomarkers
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目前已见有以胸部低剂量螺旋CT、支气管内镜、痰脱落细胞等作为筛查方法进行早期肺癌诊断的多项研究报告，但这些方法的敏感度、特异度和适用性等均存在一定的局限性。随着分子生物学理论的快速发展、相关检测方法的不断改进，分子诊断已成为肿瘤病理学研究的主要内容和手段。近年来，国内外学者对生物标志物用于肺癌早期诊断进行了大量研究，本文就其研究进展作一概要介绍。
1 血清蛋白标志物
1.1 血清肿瘤标志物
血清肿瘤标志物检测具有无创、快捷、简便等优点，成为肺癌筛查及其辅助诊断的主要手段。现阶段临床上常用的血清肺癌标志物包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolization enzyme， NSE）、鳞状上皮细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen， SCC）、细胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment， CYFRA21-1）、前胃泌素释放肽（pro-gastrin-releasing peptide， pro-GRP）等，但这些标志物单独用于肺癌早期诊断的敏感度和特异度均不高[4-7]，如癌胚抗原水平用于肺癌诊断的敏感度只有33.3% ～ 52%[5-6]。NSE和pro-GRP水平异常主要见于小细胞肺癌患者，癌胚抗原、SCC和CYRFA21-1水平异常主要见于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）患者。这些标志物的水平在不同个体间的差异较大，在同一个体中则与肿瘤负荷有一定的相关性。
为提高诊断的敏感度，多项研究探讨了多种标志物联合检测的应用价值，结果显示癌胚抗原、NSE、SCC、CYFRA21-1的三联或四联检测用于肺癌筛查的敏感度可达80% ～ 90%，特异度>70%[5-7]，显著优于这些标志物单独检测的结果。这些标志物水平异常也见于其他恶性肿瘤类型。不过，由于早期肺癌的肿瘤负荷较小，这些标志物的敏感度还是太低，特别是在肺毛玻璃结节的鉴别上，这些标志物几乎没有鉴别诊断价值。
1.2 肺癌自身抗体
在肺癌发生的早期，机体的免疫系统能识别肿瘤细胞表面的特异性抗原，然后分泌针对这些抗原的自身抗体。肺癌自身抗体在肺癌早期即出现，故可用于肺癌早期筛查[8]。然而，单独检测肺癌自身抗体用于肺癌筛查同样存在敏感度和特异度不理想的问题，而联合检测多种肺癌自身抗体可弥补这一缺陷。上海市肺科医院组织进行的一项多中心研究探讨了7种肺癌自身抗体（GAGE7、CAGE、MAGE A1、SOX2、GBU4-5、p53、PGP9.5）检测在肺癌早期诊断中的应用价值，结果显示联合检测这7种肺癌自身抗体用于肺癌筛查的敏感度和特异度分别达61.0%和90.0%，其中用于Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC诊断的敏感度分别为62%和59%，用于局限期小细胞肺癌诊断的敏感度为59%[9]。 2 循环肿瘤DNA
循环肿瘤DNA是指血液循环中的肿瘤细胞凋亡后产生的双链或单链DNA片段，其基因改变与肿瘤组织的一致。随着分子生物学技术的快速发展，如第二代基因测序技术、数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）等技术的出现，循环肿瘤DNA的检测灵敏度已大大提高，具有用于肿瘤早期诊断的潜力。肿瘤细胞在血流中凋亡后，血浆中来自不同染色体的循环肿瘤DNA片段数量与染色体拷贝数成正比，通过第二代测序技术捕获测序1 000万个DNA片段，其相应染色体的数量变化就有了统计学意义，从而可用来判断体内的肿瘤负荷和肿瘤类型[10-11]。此外，肿瘤细胞DNA携带的倒序、点突变信息也可通过测序获得[12]。
Newman等[13]在采用癌症个体化深度测序方法检测循环肿瘤DNA的研究中发现，循环肿瘤DNA检测用于肺癌诊断的敏感度在Ⅱ～ Ⅳ期和Ⅰ期NSCLC患者中分别为100.0%和50.0%，特异度均为96.0%，且循环肿瘤DNA的表达量与肿瘤大小相关，相关系数为0.89。该研究表明，采用高通量的第二代测序技术检测循环肿瘤DNA中的基因变异有助于NSCLC的早期诊断。不过，由于循环肿瘤DNA的含量较低，在早期肺癌患者中的含量更低，因此欲更好地发挥循环肿瘤DNA检测在肺癌早期诊断中的应用价值，还需不断改进检测技术、DNA抽提技术并建立多基因检测谱。
3 循环微小RNA（microRNA， miRNA）
miRNA是一类高度保守的小分子RNA，是长度为19 ～ 25个核苷酸的内源性非编码调控RNA，可通过靶向结合mRNA的3′-非翻译區而致mRNA降解或翻译受到抑制，从而实现对靶基因表达的调控。miRNA在不同组织中的表达谱不同，在肺癌与正常组织之间以及不同的肺癌组织之间的表达谱也不相同，故其检测有用于肺癌诊断的潜力。
Geng等[14]的研究发现，NSCLC患者和健康人群的循环miRNA（miRNA-20a、miRNA-145、miRNA-21、miRNA-223、miRNA-221）的表达有显著差异，故miRNA可用作早期NSCLC诊断的肿瘤标志物。Hennessey等[15]采用实时定量PCR技术检测了30例NSCLC患者和20名健康者血清中180种miRNA的表达，结果发现miR-15b和miR-27b的检测有助于NSCLC诊断，miR-15b和miR-27b检测用于NSCLC诊断的敏感度和特异度分别达100%和84%。多种miRNA的联合检测有助于提高肺癌早期诊断的敏感度和特异度。
4 循环肿瘤细胞（circulating tumor cell， CTC）
CTC是指进入了血液循环的肿瘤细胞，它们在肿瘤进展和转移中起着关键作用。由于在早期肿瘤、甚至癌前病变的患者外周血中即已存在CTC，故如能检测CTC，就可用于肿瘤早期诊断。
上海市肺科医院、上海市胸科医院和中国医学科学院肿瘤医院联合进行了一项多中心研究，采用靶向PCR技术检测了560例肺癌患者、350例肺良性肿瘤患者、150名健康者和150例非肺源性恶性肿瘤患者的CTC，结果发现CTC检测用于肺癌辅助诊断的价值显著高于血清肿瘤标志物，敏感度和特异度分别达79.6%和88.2%，其中对Ⅰ期（早期）肺癌诊断的敏感度达67.2%[16]。
5 呼出气中的有机化合物（volatile organic compounds， VOC）
VOC检测具有快速、无创、便捷、灵敏度高和可重复性好等优点，是一种潜在的新型肿瘤诊断方法。多项研究结果表明，VOC的组成及其浓度可以反映肺癌的疾病状况，建立和开发其数据库及预测模型对肺癌早期诊断具有重要的应用价值[17-18]。陈璐等[17]采用电子鼻检测了63例肺癌患者和72名健康者的VOC并予以比较，建立了肺癌预测模型，后者用于肺癌诊断的敏感度达74.0%，特异度达93.0%。
下呼吸道表面产生的代谢产物会以气溶胶形态存在于呼出气中，呼出气被引入冷凝系统后转化为液体或雪状物，即呼出气体冷凝物（exhaled breath condensate， EBC）。多项研究结果提示，通过检测EBC中的肿瘤相关基因（主要包括p53、p16、Bcl-2、K-ras等）以及微卫星改变、细胞因子、氧化应激产物等可实现肺癌的早期诊断[19-22]。有关研究发现，在33% ～ 70%的肺腺癌患者EBC中可检出p53突变[19]，在53%的肺癌患者EBC中可发现微卫星改变[20]。
6 结语
综上所述，肺癌的早期诊断是改善肺癌患者预后的关键，因此人们一直在开发肺癌早期诊断新技术。肺癌早期诊断技术除须有高敏感度和特异度外，还应具有创伤小、操作简单、成本低廉等特点。近年来，新的肿瘤相关生物标志物不断被发现，它们的检测和应用相对方便，而联合检测有助于提高肺癌诊断的敏感度和特异度，特别是血清肿瘤标志物、肺癌自身抗体和miRNA等联合检测的应用价值已进入临床研究阶段，有望成为肺癌早期诊断和筛查的有效手段。当然，在生物标志物用于肺癌早期诊断方面也存在不少问题，如较多新的肿瘤相关生物标志物的检测技术尚不成熟，检测成本很高；这些生物标志物检测用于临床实践的证据不足等。因此，临床上应进行更深入的研究或验证工作，同时更深入地了解从癌前病变至肺癌发生的动态过程，在此基础上不断研究和开发新的技术和方法，使肺癌早期诊断技术日臻完善。
参考文献
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