【摘 要】
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目的: 钓取人B细胞刺激因子基因, 构建其表达的大肠杆菌工程菌, 并体外表达、纯化可溶性B细胞刺激因子.方法: 从人外周血单个核细胞(PBMC)中提取总RNA并逆转录得到cDNA, 用PC
【机 构】
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天津大学药物科学与技术学院分子细胞药理系,军事医学科学院基础医学研究所
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目的: 钓取人B细胞刺激因子基因, 构建其表达的大肠杆菌工程菌, 并体外表达、纯化可溶性B细胞刺激因子.方法: 从人外周血单个核细胞(PBMC)中提取总RNA并逆转录得到cDNA, 用PCR扩增目的基因, 连接到原核生物表达载体pET-30a上.制备质粒后, 酶切、进行菌落PCR及DNA测序对其进行鉴定.然后转化大肠杆菌BL21(DE3)并表达.对纯化的目的蛋白进行肽质量指纹分析、鉴定, 并进一步做体外B细胞刺激试验.结果: RT-PCR钓取出可溶性B细胞刺激因子基因片段.DNA测序结果与报道序列完全一致.在IPTG诱导下, 目的基因在工程菌中表达.利用镍金属螯合琼脂糖凝胶亲和层析柱分离.纯化目的蛋白的肽质量指纹图经Mascot搜索与B细胞刺激因子吻合.纯化的蛋白在体外可刺激B细胞增殖.结论: 成功地克隆可溶性B细胞刺激因子基因, 表达的纯化目的蛋白是具有生物学活性的B细胞刺激因子.
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