【目的】基于黄草乌性状多变,针对第二内部转录间隔子(ITS2)位点对黄草乌Aconitum vilmorinianum Komarov及其2个近缘种(长喙乌头Aconitum georgei Comber、马耳山乌头Aconitum delavayi Franchet)掺混的分子进行鉴别研究。【方法】提取黄草乌及2个近缘种DNA,对ITS2区进行扩增并直接测序,比较研究黄草乌、长喙乌头和马耳山乌头不同居群的ITS2序列的特征,并对黄草乌与长喙乌头、黄草乌与马耳山乌头的粉末不同比例掺混样品进行ITS2位点序列峰值图比较分析。【结果】不同产地的黄草乌根茎性状变化较大,表现为根茎形状、长度、直径,表皮颜色等方面;16个产地黄草乌ITS2位点序列较为保守,在第113 bp、185 bp处有G/T、A/C种内变异;在ITS2位点的第169 bp、201 bp处可将黄草乌与长喙乌头和马耳山乌头鉴别开;系统发育分析表明黄草乌和长喙乌头遗传距离较近,而与马耳山乌头较远。ITS2序列峰值图的第169 bp、201 bp处亦可鉴别黄草乌掺混有1/2和2/3的长喙乌头或马耳山乌头。【结论】ITS2区段序列在一定程度上适用于鉴别黄草乌与长喙乌头或马耳山乌头掺混。