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【摘要】 目的 评价纤维支气管镜（简称纤支镜）支气管肺泡灌洗液（BALF）行萤光定量PCR检测TB-DNA对菌阴肺结核的临床诊断意义。方法 选菌阴肺结核患者160例行纤支镜检查，进行活检、BALF培养结核杆菌及BALF行TB-DNA测定。结果 160例经纤支镜BALF培养结核杆菌、BALF行TB-DNA测定阳性的检出率分别是63.33%和81.67%；其中100例行纤支镜活检，经病理证实符合结核的68例，检出率68%。结论 支气管肺泡灌洗液TB-DNA测定对菌阴肺结核具有较高的临床诊断意义。
【关键词】 TB-DNA；支气管灌洗液；结核
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.09.057 文章编号：1004-7484（2013）-09-4840-01
临床上菌阴肺结核病人因其临床症状及影像学不典型、多变且无特异性，容易误诊、漏诊，给临床诊断带来困难，为此我们对我院2009——2011年160例菌阴肺结核病人行纤支镜支气管肺泡灌洗液（BALF）中TB-DNA测定，探讨支气管肺泡灌洗液（BALF）中TB-DNA测定对菌阴肺结核的临床诊断意义。
1 资料和方法
1.1 临床资料 160例研究对象系我院2009——2011年住院病人，均为不明原因肺部阴影，既往无结核病史。均行纤支镜支气管肺泡灌洗液（BALF）中TB-DNA测定，男性90例，女性70例，年龄16-68岁，平均年龄42岁。分别为咳嗽、无痰及体检发现肺部阴影就诊，且不具备结核病临床表现，胸部CT可见阴影，均不在肺部结核病好发部位（如上叶尖后段、下叶背段），经6次痰涂片找结核菌阴性，PPD阴性，痰结核菌培养阴性，为明确诊断均行纤支镜检查，进行活检、BALF培养结核杆菌及BALF行TB-DNA定性测定。
1.2 方法
1.2.1 纤支镜取材及标本处理方法 纤支镜常规进行，依据胸部CT确定部位，纤支镜下观察气管、支气管情况，参照影像学所示的病灶位置，在相应的段或亚段TBLB夹取3-5块组织，用10%福尔马林液固定送病理检查，后再以37℃无菌生理盐水20ml分3次在相应的肺段灌洗，随后负压吸引，回收量应达30%以上。收集的BALF做结核菌培养及TB-DNA定性测定。
1.2.2 PCR法检测 试剂采用中山大学达安基因股份有限公司PCR检测试剂盒，仪器采用美国ABI-7500PCR分析仪器，操作步骤严格按说明进行。
1.3 病例诊断标准 刷检、术后痰涂片抗酸染色查结核菌、灌洗液结核菌培养、病理活检，至少1项阳性者，诊断为肺结核。
1.4 统计学方法 采用x2检验，P<0.05具有统计学意义。
2 结果
160例经纤支镜BALF培养结核杆菌（101/160）、BALF行TB-DNA测定阳性（131/160）的检出率分别是63.33%和81.67%，见表1，BALF行TB-DNA测定阳性率高于纤支镜BALF培养结核杆菌（x2=28.03，P<0.05），其中100例行纤支镜活检，经病理证实符合结核的68例，检出率68%，在行纤支镜活检的100例病例中，BALF行TB-DNA测定阳性率80%，见表2，BALF行TB-DNA测定阳性率高于纤支镜活检（x2=10.08，P<0.05）。在行纤支镜检查过程中72例病人术后1-3天均有少量出血，28例出血较多，出血量约10-50ml不等，经气管内肾上腺素止血对症处理后很快消失，无大咯血、气胸、心血管病症等严重并发症发生。
3 讨论
自20世纪80年代中期以来，结核病出现全球性恶化趋势，大多数结核病疫情很低的发达国家结核病卷土重来，众多发展中国家的结核病疫情出现明显回升，全球约有三分之一的人曾受到结核分枝杆菌的感染，每年有800-1000万新发病例及300万人死于该病，结核病再度成为危害人类健康的重大公共卫生问题，故早期诊断对结核病的防治意义重大。痰涂片抗酸杆菌和结核菌培养是目前诊断肺结核的金标准。涂片法简单、快速、经济，但灵敏性差，检出率低，通常5000-10000条菌/ml才能得到阳性结果，且不能将结核杆菌与其他分支杆菌区分开来[1]。培养法一般要4-8周，快速培养也要2周。这些均影响结核病的诊断和防治工作。要控制结核的发生和流行，准确及时地诊断结核病，对菌阴肺结核的诊断是重要的一环。但菌阴肺结核的诊断缺乏金标准[2]，其中大多数的诊断主要依据仍然是临床表现和影像学特征，误诊和漏诊现象时有发生，是结核病防治工作中的棘手问题。
1985年Mullis创建了PCR技术，1989年Hance等首先将该技术应用于检测分枝杆菌，从而开辟了以PCR为代表的分子生物学技术检测结核分枝杆菌阶段。PCR技术高灵敏度，高特异性，可检测1-100fg纯化结核分枝杆菌DNA，为菌阴肺结核患者的诊断提供了良好的前景。但由于常規PCR技术存在扩增产物污染带来的假阳性和不能定量的问题，使其难以发挥有效作用。本文使用的方法为荧光定量PCR（FQ-PCR）技术，其集PCR和DNA探针杂交技术的优点为一体，直接探测PCR过程中的荧光变化，获得DNA模板的准确定量结果。整个过程在闭管状态下进行，避免了因污染而导致的假阳性，使结果准确可靠，具有高敏感性、高特异性、高精确性特点[3]。李素华等[4]的研究显示使用实时荧光定量PCR法对临床192例各检样进行TB-DNA检测，其中脓液、肺泡灌洗液、痰液和胸水中的阳性率最高，分别达到47.4%、25.7%、30.4%、8.7%。本文显示支气管肺泡灌洗液结核DNA检测阳性率均高于纤支镜BALF培养结核杆菌及纤支镜活检阳性率，且由于BALF直接取自病灶处支气管肺泡内，细菌浓度高，污染几率低，且无痰患者也可以检测，使阳性率大大提高，从而进一步增加了PCR检测肺结核的敏感性和特异性，且行肺泡灌洗的病例纤支镜术后出血、气胸等的并发症低于纤支镜活检。
总之，支气管肺泡灌洗液直接取材于病变部位，通过纤支镜负压吸出，避免了其他菌的污染，准确性高[5]。检测肺泡灌洗液TB-DNA是快速诊断结核感染的一种方法，尤其是为菌阴肺结核的诊断和鉴别诊断提供了有力证据。但PCR不能区分死菌与活菌，对于治愈的肺结核，如果肺内有死的结核杆菌，PCR检测仍可为阳性，因此对病情的判断还应结合临床其他检查结果综合判断。
参考文献
[1] 张翊，卢建平，叶淼.四种结核分枝杆菌检测方法的临床应用评价.中国防痨杂志，2006，28（1）：14-17.
[2] 周林，成诗明，黄飞，等.县级结核病防治机构胸部X线诊断现状分析.中国健康教育，2006，22（8）：587-588.
[3] 韩俊英，曾瑞萍.荧光定量PCR技术及其应用[J].国外遗传学分册，2000，3（23）：117-120.
[4] 李素华，陈莉，王欢.荧光定量PCR检测TB-DNA在各类检样中的阳性率分析，2007，17（6）：752-753.
[5] 彭勋，常占平，王洪芬，等.纤维支气管镜检查对不典型肺结核的诊断价值.河北医药，2004，26：870-871.
【关键词】 TB-DNA；支气管灌洗液；结核
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.09.057 文章编号：1004-7484（2013）-09-4840-01
临床上菌阴肺结核病人因其临床症状及影像学不典型、多变且无特异性，容易误诊、漏诊，给临床诊断带来困难，为此我们对我院2009——2011年160例菌阴肺结核病人行纤支镜支气管肺泡灌洗液（BALF）中TB-DNA测定，探讨支气管肺泡灌洗液（BALF）中TB-DNA测定对菌阴肺结核的临床诊断意义。
1 资料和方法
1.1 临床资料 160例研究对象系我院2009——2011年住院病人，均为不明原因肺部阴影，既往无结核病史。均行纤支镜支气管肺泡灌洗液（BALF）中TB-DNA测定，男性90例，女性70例，年龄16-68岁，平均年龄42岁。分别为咳嗽、无痰及体检发现肺部阴影就诊，且不具备结核病临床表现，胸部CT可见阴影，均不在肺部结核病好发部位（如上叶尖后段、下叶背段），经6次痰涂片找结核菌阴性，PPD阴性，痰结核菌培养阴性，为明确诊断均行纤支镜检查，进行活检、BALF培养结核杆菌及BALF行TB-DNA定性测定。
1.2 方法
1.2.1 纤支镜取材及标本处理方法 纤支镜常规进行，依据胸部CT确定部位，纤支镜下观察气管、支气管情况，参照影像学所示的病灶位置，在相应的段或亚段TBLB夹取3-5块组织，用10%福尔马林液固定送病理检查，后再以37℃无菌生理盐水20ml分3次在相应的肺段灌洗，随后负压吸引，回收量应达30%以上。收集的BALF做结核菌培养及TB-DNA定性测定。
1.2.2 PCR法检测 试剂采用中山大学达安基因股份有限公司PCR检测试剂盒，仪器采用美国ABI-7500PCR分析仪器，操作步骤严格按说明进行。
1.3 病例诊断标准 刷检、术后痰涂片抗酸染色查结核菌、灌洗液结核菌培养、病理活检，至少1项阳性者，诊断为肺结核。
1.4 统计学方法 采用x2检验，P<0.05具有统计学意义。
2 结果
160例经纤支镜BALF培养结核杆菌（101/160）、BALF行TB-DNA测定阳性（131/160）的检出率分别是63.33%和81.67%，见表1，BALF行TB-DNA测定阳性率高于纤支镜BALF培养结核杆菌（x2=28.03，P<0.05），其中100例行纤支镜活检，经病理证实符合结核的68例，检出率68%，在行纤支镜活检的100例病例中，BALF行TB-DNA测定阳性率80%，见表2，BALF行TB-DNA测定阳性率高于纤支镜活检（x2=10.08，P<0.05）。在行纤支镜检查过程中72例病人术后1-3天均有少量出血，28例出血较多，出血量约10-50ml不等，经气管内肾上腺素止血对症处理后很快消失，无大咯血、气胸、心血管病症等严重并发症发生。
3 讨论
自20世纪80年代中期以来，结核病出现全球性恶化趋势，大多数结核病疫情很低的发达国家结核病卷土重来，众多发展中国家的结核病疫情出现明显回升，全球约有三分之一的人曾受到结核分枝杆菌的感染，每年有800-1000万新发病例及300万人死于该病，结核病再度成为危害人类健康的重大公共卫生问题，故早期诊断对结核病的防治意义重大。痰涂片抗酸杆菌和结核菌培养是目前诊断肺结核的金标准。涂片法简单、快速、经济，但灵敏性差，检出率低，通常5000-10000条菌/ml才能得到阳性结果，且不能将结核杆菌与其他分支杆菌区分开来[1]。培养法一般要4-8周，快速培养也要2周。这些均影响结核病的诊断和防治工作。要控制结核的发生和流行，准确及时地诊断结核病，对菌阴肺结核的诊断是重要的一环。但菌阴肺结核的诊断缺乏金标准[2]，其中大多数的诊断主要依据仍然是临床表现和影像学特征，误诊和漏诊现象时有发生，是结核病防治工作中的棘手问题。
1985年Mullis创建了PCR技术，1989年Hance等首先将该技术应用于检测分枝杆菌，从而开辟了以PCR为代表的分子生物学技术检测结核分枝杆菌阶段。PCR技术高灵敏度，高特异性，可检测1-100fg纯化结核分枝杆菌DNA，为菌阴肺结核患者的诊断提供了良好的前景。但由于常規PCR技术存在扩增产物污染带来的假阳性和不能定量的问题，使其难以发挥有效作用。本文使用的方法为荧光定量PCR（FQ-PCR）技术，其集PCR和DNA探针杂交技术的优点为一体，直接探测PCR过程中的荧光变化，获得DNA模板的准确定量结果。整个过程在闭管状态下进行，避免了因污染而导致的假阳性，使结果准确可靠，具有高敏感性、高特异性、高精确性特点[3]。李素华等[4]的研究显示使用实时荧光定量PCR法对临床192例各检样进行TB-DNA检测，其中脓液、肺泡灌洗液、痰液和胸水中的阳性率最高，分别达到47.4%、25.7%、30.4%、8.7%。本文显示支气管肺泡灌洗液结核DNA检测阳性率均高于纤支镜BALF培养结核杆菌及纤支镜活检阳性率，且由于BALF直接取自病灶处支气管肺泡内，细菌浓度高，污染几率低，且无痰患者也可以检测，使阳性率大大提高，从而进一步增加了PCR检测肺结核的敏感性和特异性，且行肺泡灌洗的病例纤支镜术后出血、气胸等的并发症低于纤支镜活检。
总之，支气管肺泡灌洗液直接取材于病变部位，通过纤支镜负压吸出，避免了其他菌的污染，准确性高[5]。检测肺泡灌洗液TB-DNA是快速诊断结核感染的一种方法，尤其是为菌阴肺结核的诊断和鉴别诊断提供了有力证据。但PCR不能区分死菌与活菌，对于治愈的肺结核，如果肺内有死的结核杆菌，PCR检测仍可为阳性，因此对病情的判断还应结合临床其他检查结果综合判断。
参考文献
[1] 张翊，卢建平，叶淼.四种结核分枝杆菌检测方法的临床应用评价.中国防痨杂志，2006，28（1）：14-17.
[2] 周林，成诗明，黄飞，等.县级结核病防治机构胸部X线诊断现状分析.中国健康教育，2006，22（8）：587-588.
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[4] 李素华，陈莉，王欢.荧光定量PCR检测TB-DNA在各类检样中的阳性率分析，2007，17（6）：752-753.
[5] 彭勋，常占平，王洪芬，等.纤维支气管镜检查对不典型肺结核的诊断价值.河北医药，2004，26：870-871.