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摘要：以高山石斛（Dendrobium infundibulum Lindl.）成熟种子为外植体，MS为基本培养基，研究植物生长调节素对高山石斛组织培养过程中继代增殖和生根的影响。结果表明，高山石斛最佳的启动培养基为MS 6-BA 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L；继代增殖中，6-BA、NAA、KT等激素的配合使用具有较好的效果，利于继代增殖的培养基为MS 6-BA 3.0 mg/L NAA 1.0 mg/L KT 0.5 mg/L 活性炭1.0 g/L；最佳的生根壮苗培养基为MS 6-BA 0.5 mg/L NAA 2.0 mg/L 香蕉汁10%，此时苗的根系长而粗壮，芽苗叶色翠绿，平均根长2.79 cm，生根率达到92%。
关键词：高山石斛；6-BA；NAA；KT；组织培养；继代培养基；生根培养基
中图分類号： S567.23 9.043 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0050-02
高山石斛（Dendrobium infundibulum Lindl.）产于云南南部，系兰科石斛属多年生草本植物，生于海拔约2 000 m的密林中树干上，喜温暖、潮湿环境[1]。高山石斛被誉为“四大观赏洋花”之一，具有极高的观赏价值，花期为每年的8—11月，其总状花序来自具叶的顶端，具1～2朵花，花姿优雅，气味芳香，既可做切花，可用于插花和餐桌的布置[2]，也可做盆栽。自然条件下，石斛属植物的种子细小，不具胚乳，繁殖能力极低，主要通过分株方式繁殖[3]，而这种繁殖方法周期长，短时间内得到的有效苗数少。高山石斛的培植推广受到种苗生产的制约[4]。近年来，随着市场需求量的日益增大，原本自然资源稀缺，加之人们盲目过度采挖，使高山石斛的野生资源受到严重破坏[5]。本试验以MS为基本培养基，通过不同植物生长调节剂的配比应用，对高山石斛进行组织培养技术研究，筛选出高山石斛各个生长培养阶段的优势培养基，加快其繁殖速度，以期使高山石斛野生资源得到有效保护，同时降低组培成本，为高山石斛大规模的组培苗生产提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
高山石斛未开裂成熟蒴果，采自广西壮族自治区药用植物园科研基地内健壮、无病害的植株上。
1.2 组织培养
1.2.1 外植体消毒与启动培养 将高山石斛成熟饱满、未开裂的蒴果用流水清洗表面污垢，置于烧杯中依次用2%洗洁精溶液浸泡5 min，用线状的自流水冲洗15 min；移至超净工作台，用75%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗2次；用添加2滴吐温-20的0.1% HgCl2浸泡15 min，无菌水浸泡冲洗3次；用消毒的滤纸除去表面水分，用无菌解剖刀将高山石斛蒴果的果皮轻轻切开，用无菌镊子将胚均匀撒播在以MS为基本培养基、添加不同浓度植物生长剂（6-BA、NAA）的启动培养基上，观察接入外植体的变化。
1.2.2 继代增殖 将经过初代培养获得的无菌芽切为独立的单芽，接种于以MS为基本培养基，添加30 g/L蔗糖、4.5 g/L 琼脂、1 g/L活性炭、不同浓度植物生长调节剂（1.0～4.0 mg/L 6-BA、0.5～1.0 mg/L NAA、0～0.5 mg/L KT）的继代增殖培养基上培养，pH值为5.8。重复3次。
1.2.3 生根培养 将继代增殖培养生长至3 cm左右的健壮单株从丛芽中剥离，接种至添加不同浓度植物生长调节剂（6-BA、NAA）和植物提取液的MS基本培养基上进行壮苗生根培养60 d，pH值为5.8；调查统计高山石斛生根的情况。每种培养基接种50株。
1.3 组织培养条件
温度24～28 ℃，光照时间为12 d/h，平均光照为1 500～2 200 lx。
1.4 炼苗移栽
挑取生长健壮、根系发达的高山石斛组培苗移入大棚温室内，打开瓶盖放置7 d，期间往瓶内组培苗喷洒少量水，保持瓶内水分充足；将瓶内幼苗取出，流水冲洗干净根部的培养基，避免损伤根部的幼嫩组织；将幼苗于傍晚移栽至经消毒过的栽培基质中，保持湿度，上部覆盖1层遮阳网适度遮阴。
2 结果与分析
2.1 种子的萌发情况
种子接入诱导培养基培养25 d，大部分种子都固着在培养基表面，可明显地观察到种子胚开始变大，由淡黄色慢慢变成淡绿色；随培养时间的增加，淡绿色转变为深绿，萌发为原球茎；培养60 d，膨大的原球茎顶端产生叶原基突起，原球茎开始慢慢分化，出现芽尖，并逐渐长成芽苗。由表1可见，6-BA、NAA都对高山石斛芽的诱导产生影响；6-BA浓度不变时，NAA浓度增大有利于芽的萌发；NAA浓度不变时，6-BA 在0.1～0.5 mg/L范围内，浓度过高反而会使芽的萌发率下降；在MS 6-BA 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L培养基上，高山石斛种子的萌发个数相对最多，芽苗颜色浓绿，长势良好（图1）。因此，MS 6-BA 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L为最佳诱导培养基。
2.2 继代增殖
由表2可见，以MS为基本培养基、添加不同激素的12种培养基中，无菌芽苗接入增殖培养基30 d开始分化，芽的增殖倍数有明显差异；NAA、KT保持浓度不变，6-BA浓度为3.0 mg/L时芽的增殖能力相对较强，芽的增殖倍数为3.7～4.6（培养基编号为B7～B9），随着6-BA浓度增加，芽的增殖倍数有所下降，且苗生长过快，茎较细弱，有效苗的质量变差；6-BA、NAA保持浓度不变时，培养基中加入KT有利于苗的增殖；培养基MS 6-BA 3.0 mg/L NAA 1.0 mg/L KT 0.5 mg/L 活性炭1.0 g/L芽的增殖能力最强，增殖倍数达到4.6，芽生长情况良好，苗健壮，叶色翠绿（图2）。因此，确定培养基MS 6-BA 3.0 mg/L NAA 1.0 mg/L KT 0.5 mg/L 活性炭1.0 g/L为高山石斛芽苗的最适增殖培养基。 2.3 生根培养
由表3可见，高山石斛在MS 6-BA 0.5 mg/L NAA 2.0 mg/L 香蕉汁10%的培养基上生根率和生根数分别为92%、46条，平均根长达2.79 cm，且芽苗叶色翠绿，植株健壮，根系长而粗壮，主次分明（图3），优于其他组合；6-BA浓度保持不变时，随NAA浓度的增大，高山石斛芽苗的生根率提高、生根数有所增加，NAA浓度为2.0 mg/L时生根效果相对最好，浓度过高反而不利于根的生长。
2.4 炼苗移栽
试验表明，炼苗基质以木屑 ∶草炭=2 ∶1为宜，栽好幼苗再覆盖1层苔藓，浇透水定根，同时保持棚内湿度85%左右、温度为20～30 ℃，15 d左右长出新根去掉遮阳网，此时，幼苗成活率高，生长健壮。
3 结论与讨论
组织培养过程中，只有植物生长调节剂配比恰当，才有利于组培苗的生长、 分化和快速繁殖[6]。MS培养基适合于大多
数的双子叶植物，但不同品种在种子萌发和增殖过程中需要的激素浓度有很大区别[7]。本试验中，MS基本培养基中加入适宜的6-BA、NAA，可促进高山石斛种子的萌发，较适宜种子萌发的培养基为MS 6-BA 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L，NAA浓度不变时，6-BA浓度过高反而会抑制萌发。
幼苗增殖和分化是组织培养过程中繁殖速度和增殖系数的关键[8]，而组培苗的增殖系数很大程度上受细胞分裂素的影响。试验表明，随6-BA浓度的增大，繁殖系数有所提高，但当6-BA浓度达到4.0 mg/L时，繁殖系数反而有所降低。KT作为外源性细胞分裂素，可以促进侧芽发育[9]。在高山石斛继代增殖过程中，6-BA、NAA、KT等激素的联合使用，对芽苗的增殖起到较为理想的效果，高山石斛在培养基MS 6-BA 3.0 mg/L NAA 1.0 mg/L KT 0.5 mg/L 活性炭 1.0 g/L 中的继代增殖效果相对最佳，芽生长情况良好，苗健壮，叶色翠绿，增殖倍数达到4.6，且得到的有效苗数最多。
植物生长调节剂NAA對高山石斛的壮苗生根起到重要作用，与植物提取液香蕉汁配合使用生根效果较好，培养出的种苗植株健壮，主根系长而粗壮，成活率高。因此，最适宜壮苗生根的培养基为MS 6-BA 0.5 mg/L NAA 2.0 mg/L 香蕉汁10%。
高山石斛喜温暖、潮湿的环境，移栽时关键是选取合适的栽培基质。以木屑 ∶草炭灰=2 ∶1作为栽培基质，并覆盖1层苔藓，既疏松又保水透气，是一种较好的栽培基质。
参考文献：
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M]. 北京：科学出版社，1979.
[2]张 娟. 秋石斛组织培养的研究[J]. 湖北林业科技，2015，44（3）：20-22.
[3]宋 顺，许 奕，王必尊. 不同培养基成分对铁皮石斛组织培养的影响[J]. 中国农学通报，2013，29（13）：133-139.
[4]徐 红，刘 俊，王峥涛，等. 鼓槌石斛组织培养研究[J]. 中国中药杂志，2001，26（6）：378-381.
[5]张 敏，孙红绪，聂 春. 黄草石斛组织培养技术研究[J]. 上海农业科技，2015（1）：34-35.
[6]魏丽芳，于桂芬，冯国宝. 铁皮石斛组织培养与快速繁殖研究进展[J]. 安徽农业科学，2013，41（35）：13561-13563.
[7]蒋 林，卓 宇，莫昭展. 流苏石斛丛生芽增殖和生根的研究[J]. 时珍国医国药，2012，23（9）：5380-5382.
[8]张 明，夏鸿西. 石斛组织培养研究进展[J]. 中国中药杂志，2000，25（6）：323-326.
[9]张占江，李 翠，吕惠珍，等. 条叶唇柱苣苔组织培养研究[J]. 种子，2013，32（9）：19-22.米美多，慕 宇，代晓华，等. 花后高温胁迫下不同施氮量对春小麦抗氧化特性的影响[J]. 江苏农业科学，2017，45（1）：52-56.
关键词：高山石斛；6-BA；NAA；KT；组织培养；继代培养基；生根培养基
中图分類号： S567.23 9.043 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0050-02
高山石斛（Dendrobium infundibulum Lindl.）产于云南南部，系兰科石斛属多年生草本植物，生于海拔约2 000 m的密林中树干上，喜温暖、潮湿环境[1]。高山石斛被誉为“四大观赏洋花”之一，具有极高的观赏价值，花期为每年的8—11月，其总状花序来自具叶的顶端，具1～2朵花，花姿优雅，气味芳香，既可做切花，可用于插花和餐桌的布置[2]，也可做盆栽。自然条件下，石斛属植物的种子细小，不具胚乳，繁殖能力极低，主要通过分株方式繁殖[3]，而这种繁殖方法周期长，短时间内得到的有效苗数少。高山石斛的培植推广受到种苗生产的制约[4]。近年来，随着市场需求量的日益增大，原本自然资源稀缺，加之人们盲目过度采挖，使高山石斛的野生资源受到严重破坏[5]。本试验以MS为基本培养基，通过不同植物生长调节剂的配比应用，对高山石斛进行组织培养技术研究，筛选出高山石斛各个生长培养阶段的优势培养基，加快其繁殖速度，以期使高山石斛野生资源得到有效保护，同时降低组培成本，为高山石斛大规模的组培苗生产提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
高山石斛未开裂成熟蒴果，采自广西壮族自治区药用植物园科研基地内健壮、无病害的植株上。
1.2 组织培养
1.2.1 外植体消毒与启动培养 将高山石斛成熟饱满、未开裂的蒴果用流水清洗表面污垢，置于烧杯中依次用2%洗洁精溶液浸泡5 min，用线状的自流水冲洗15 min；移至超净工作台，用75%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗2次；用添加2滴吐温-20的0.1% HgCl2浸泡15 min，无菌水浸泡冲洗3次；用消毒的滤纸除去表面水分，用无菌解剖刀将高山石斛蒴果的果皮轻轻切开，用无菌镊子将胚均匀撒播在以MS为基本培养基、添加不同浓度植物生长剂（6-BA、NAA）的启动培养基上，观察接入外植体的变化。
1.2.2 继代增殖 将经过初代培养获得的无菌芽切为独立的单芽，接种于以MS为基本培养基，添加30 g/L蔗糖、4.5 g/L 琼脂、1 g/L活性炭、不同浓度植物生长调节剂（1.0～4.0 mg/L 6-BA、0.5～1.0 mg/L NAA、0～0.5 mg/L KT）的继代增殖培养基上培养，pH值为5.8。重复3次。
1.2.3 生根培养 将继代增殖培养生长至3 cm左右的健壮单株从丛芽中剥离，接种至添加不同浓度植物生长调节剂（6-BA、NAA）和植物提取液的MS基本培养基上进行壮苗生根培养60 d，pH值为5.8；调查统计高山石斛生根的情况。每种培养基接种50株。
1.3 组织培养条件
温度24～28 ℃，光照时间为12 d/h，平均光照为1 500～2 200 lx。
1.4 炼苗移栽
挑取生长健壮、根系发达的高山石斛组培苗移入大棚温室内，打开瓶盖放置7 d，期间往瓶内组培苗喷洒少量水，保持瓶内水分充足；将瓶内幼苗取出，流水冲洗干净根部的培养基，避免损伤根部的幼嫩组织；将幼苗于傍晚移栽至经消毒过的栽培基质中，保持湿度，上部覆盖1层遮阳网适度遮阴。
2 结果与分析
2.1 种子的萌发情况
种子接入诱导培养基培养25 d，大部分种子都固着在培养基表面，可明显地观察到种子胚开始变大，由淡黄色慢慢变成淡绿色；随培养时间的增加，淡绿色转变为深绿，萌发为原球茎；培养60 d，膨大的原球茎顶端产生叶原基突起，原球茎开始慢慢分化，出现芽尖，并逐渐长成芽苗。由表1可见，6-BA、NAA都对高山石斛芽的诱导产生影响；6-BA浓度不变时，NAA浓度增大有利于芽的萌发；NAA浓度不变时，6-BA 在0.1～0.5 mg/L范围内，浓度过高反而会使芽的萌发率下降；在MS 6-BA 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L培养基上，高山石斛种子的萌发个数相对最多，芽苗颜色浓绿，长势良好（图1）。因此，MS 6-BA 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L为最佳诱导培养基。
2.2 继代增殖
由表2可见，以MS为基本培养基、添加不同激素的12种培养基中，无菌芽苗接入增殖培养基30 d开始分化，芽的增殖倍数有明显差异；NAA、KT保持浓度不变，6-BA浓度为3.0 mg/L时芽的增殖能力相对较强，芽的增殖倍数为3.7～4.6（培养基编号为B7～B9），随着6-BA浓度增加，芽的增殖倍数有所下降，且苗生长过快，茎较细弱，有效苗的质量变差；6-BA、NAA保持浓度不变时，培养基中加入KT有利于苗的增殖；培养基MS 6-BA 3.0 mg/L NAA 1.0 mg/L KT 0.5 mg/L 活性炭1.0 g/L芽的增殖能力最强，增殖倍数达到4.6，芽生长情况良好，苗健壮，叶色翠绿（图2）。因此，确定培养基MS 6-BA 3.0 mg/L NAA 1.0 mg/L KT 0.5 mg/L 活性炭1.0 g/L为高山石斛芽苗的最适增殖培养基。 2.3 生根培养
由表3可见，高山石斛在MS 6-BA 0.5 mg/L NAA 2.0 mg/L 香蕉汁10%的培养基上生根率和生根数分别为92%、46条，平均根长达2.79 cm，且芽苗叶色翠绿，植株健壮，根系长而粗壮，主次分明（图3），优于其他组合；6-BA浓度保持不变时，随NAA浓度的增大，高山石斛芽苗的生根率提高、生根数有所增加，NAA浓度为2.0 mg/L时生根效果相对最好，浓度过高反而不利于根的生长。
2.4 炼苗移栽
试验表明，炼苗基质以木屑 ∶草炭=2 ∶1为宜，栽好幼苗再覆盖1层苔藓，浇透水定根，同时保持棚内湿度85%左右、温度为20～30 ℃，15 d左右长出新根去掉遮阳网，此时，幼苗成活率高，生长健壮。
3 结论与讨论
组织培养过程中，只有植物生长调节剂配比恰当，才有利于组培苗的生长、 分化和快速繁殖[6]。MS培养基适合于大多
数的双子叶植物，但不同品种在种子萌发和增殖过程中需要的激素浓度有很大区别[7]。本试验中，MS基本培养基中加入适宜的6-BA、NAA，可促进高山石斛种子的萌发，较适宜种子萌发的培养基为MS 6-BA 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L，NAA浓度不变时，6-BA浓度过高反而会抑制萌发。
幼苗增殖和分化是组织培养过程中繁殖速度和增殖系数的关键[8]，而组培苗的增殖系数很大程度上受细胞分裂素的影响。试验表明，随6-BA浓度的增大，繁殖系数有所提高，但当6-BA浓度达到4.0 mg/L时，繁殖系数反而有所降低。KT作为外源性细胞分裂素，可以促进侧芽发育[9]。在高山石斛继代增殖过程中，6-BA、NAA、KT等激素的联合使用，对芽苗的增殖起到较为理想的效果，高山石斛在培养基MS 6-BA 3.0 mg/L NAA 1.0 mg/L KT 0.5 mg/L 活性炭 1.0 g/L 中的继代增殖效果相对最佳，芽生长情况良好，苗健壮，叶色翠绿，增殖倍数达到4.6，且得到的有效苗数最多。
植物生长调节剂NAA對高山石斛的壮苗生根起到重要作用，与植物提取液香蕉汁配合使用生根效果较好，培养出的种苗植株健壮，主根系长而粗壮，成活率高。因此，最适宜壮苗生根的培养基为MS 6-BA 0.5 mg/L NAA 2.0 mg/L 香蕉汁10%。
高山石斛喜温暖、潮湿的环境，移栽时关键是选取合适的栽培基质。以木屑 ∶草炭灰=2 ∶1作为栽培基质，并覆盖1层苔藓，既疏松又保水透气，是一种较好的栽培基质。
参考文献：
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M]. 北京：科学出版社，1979.
[2]张 娟. 秋石斛组织培养的研究[J]. 湖北林业科技，2015，44（3）：20-22.
[3]宋 顺，许 奕，王必尊. 不同培养基成分对铁皮石斛组织培养的影响[J]. 中国农学通报，2013，29（13）：133-139.
[4]徐 红，刘 俊，王峥涛，等. 鼓槌石斛组织培养研究[J]. 中国中药杂志，2001，26（6）：378-381.
[5]张 敏，孙红绪，聂 春. 黄草石斛组织培养技术研究[J]. 上海农业科技，2015（1）：34-35.
[6]魏丽芳，于桂芬，冯国宝. 铁皮石斛组织培养与快速繁殖研究进展[J]. 安徽农业科学，2013，41（35）：13561-13563.
[7]蒋 林，卓 宇，莫昭展. 流苏石斛丛生芽增殖和生根的研究[J]. 时珍国医国药，2012，23（9）：5380-5382.
[8]张 明，夏鸿西. 石斛组织培养研究进展[J]. 中国中药杂志，2000，25（6）：323-326.
[9]张占江，李 翠，吕惠珍，等. 条叶唇柱苣苔组织培养研究[J]. 种子，2013，32（9）：19-22.米美多，慕 宇，代晓华，等. 花后高温胁迫下不同施氮量对春小麦抗氧化特性的影响[J]. 江苏农业科学，2017，45（1）：52-56.