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摘要： 为了提高好氧反硝化菌的环境耐受性和脱氮效率， 采用聚乙烯醇（PVA）、海藻酸钠（SA）和稻壳粉作为载体对好氧反硝化菌进行固定化， 并对固定化颗粒的性能进行评价. 结果如下： 固定化颗粒最佳配比为12%聚乙烯醇（PVA）、8%海藻酸钠（SA）、0.5 g稻壳粉和10 mL菌液; 固定化颗粒具有较好的稳定性和传质性， 48 h的总氮（TN）去除率为89.35% ～ 90.12%. 固定化颗粒对pH值和转速具有良好的耐受性， pH值为11时， TN去除率为90%; 120 r/min时TN和NH4+-N去除率最高， 分别为91.29%和93.30%; 固定化颗粒不耐低温（10℃和15℃）， 在10℃时， TN去除率仅为20%左右; 但是在30℃时， TN去除率可达90.59%.
关键词： 好氧反硝化菌; 固定化; 脱氮
中图分类号： X522 文献标志码： A DOI： 10.3969/j.issn.1000-5641.2021.04.001
Immobilization and efficacy of an aerobic denitrifier
YIN Chao1，2，3，4， LI Ying1，2，3，4， ZHANG Tingyue1，2，3，4， LIU Jiamin1，2，3，4， CHEN Tida1，2，3，4， CUI Dan1，2，3，4， HUANG Minsheng1，2，3，4
（1. Shanghai Key Laboratory for Urban Ecological Processes and Eco-Restoration， School of Ecological and Environmental Sciences， East China Normal University， Shanghai 200241， China; 2. Institute of EcoChongming， Shanghai 202162， China; 3. Shanghai Engineering Rearch Center of Biotransformation of Organic Solid Waste， Shanghai 200241， China; 4. Technology Innovation Center for Land Spatial EcoRestoration in Metropolitan Area （Ministry of Natural Resources）， Shanghai 200062， China）
Abstract： To improve the environmental tolerance and nitrogen removal efficiency of an aerobic denitrifier， polyvinyl alcohol （PVA）， sodium alginate （SA）， and rice hull powder were used as immobilized carriers for an aerobic denitrifier and the performance was subsequently evaluated. The results showed that the optimal ratio of immobilized particles was a mixture of 12% PVA， 8% sodium alginate （SA）， 0.5 g rice hull powder， and 10 mL bacterial solution. The immobilized particles had strong stability and mass transfer capability; the removal efficiency of TN was 89.35% ～ 90.12% over 48h. The immobilized particles had good tolerance to pH and rotating speed. When the pH was 11， the removal efficiency of TN was 90%. The removal efficiency of TN and NH4+-N was the highest （91.29% and 93.30%， respectively） when the speed was 120 r/min. The immobilized particles were not resistant to low temperatures （10℃ and 15℃）， and the TN removal efficiency was only about 20% at 10℃. The TN removal efficiency， however， achieved 90.59% at 30℃.
Keywords： aerobic denitrifer; immobilization; denitrification
0 引 言
好氧反硝化菌因同時具有硝化-反硝化功能、环境适应性强等特点而逐渐成为处理氮污染水体的新生力量[1-4]. 但是实际工程中若直接利用好氧反硝化菌修复水体， 很可能会因为水量波动、雨水冲刷、噬菌体吞噬、有毒物质抑制等因素导致菌体流失、死亡， 使得水体的修复效果变差[5-6]. 研究表明，利用包埋固定化技术固定微生物能够提高微生物抗冲击能力、防止微生物流失、提高脱氮效率[7-9]. 例如， 将海藻酸钠（SA）与Klebsiella sp. FC61细菌混合固定， NH4+-N去除率由61.37%提高到72.15%[10];利用固定化技术包埋活性污泥后， NH4+-N去除率能达100%[11]. Zhou等[12]利用氧化石墨烯（GO）对聚乙烯醇（PVA）进行改性， 发现改性组的COD去除率比未改性组提高10%. 现阶段研究微生物固定化主要还集中于价格昂贵的材料， 大规模使用的可操作性仍值得商榷. 探索利用廉价添加剂（稻壳粉）作为固定化材料， 不仅降低固定化成本、提供碳源、增加孔隙率， 而且能有效解决农林废弃物的问题. 基于此， 本研究以前期筛选出的好氧反硝化菌群LHJ-1为研究对象， 探讨以PVA、SA和稻壳粉为主要固定化材料对好氧反硝化菌的脱氮性能进行提升; 并探究固定化材料的最佳配比及固定化颗粒对环境因子（转速、pH值、温度）的耐受性进行分析， 旨在为好氧反硝化菌固定化技术在实际氮超标的城镇污水的应用上提供一定的理论指导.
1 材料与方法
1.1 好氧反硝化菌及DTM培养基
好氧反硝化菌主要来自龙泓涧底泥的富集培养. DTM液体培养基由C4H4Na2O4 0.405 1 g/L、KNO3 1.000 0 g/L、KH2PO4 0.007 0 g/L、K2HPO4 0.027 0 g/L、MgSO4 0.005 0 g/L和微量元素溶液（2.000 0 mL/L）组成. 其中， 微量元素溶液组成由EDTA 100.0 mg/L、ZnSO4 4.4 mg/L、CaCl2 11.0 mg/L、MnCl2·7H2O 10.2 mg/L、FeSO4·7H2O 10.0 mg/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 2.2 mg/L、CuSO4·5H2O 3.2 mg/L、CoCl2·6H2O 3.2 mg/L组成[13].
1.2 固定化颗粒制备
向含100 mL水烧杯中加入定量的PVA、SA、稻壳粉， 用无菌封口膜封住并置于水浴锅（85℃）中溶解. 待冷却至室温后加入定量菌液并缓慢搅拌， 避免产生气泡， 然后放入生化培养箱中培养4 h. 同时， 向饱和硼酸溶液中加入3%的CaCl2， 并调节pH值至6.5 ～ 7.0， 配制成交联剂. 培养4 h后用医用注射器将PVA-SA-稻壳粉混合液缓慢加入CaCl2-硼酸饱和溶液中， 并使用玻璃棒缓慢搅拌， 防止颗粒粘连， 交联4 h后转入0.5 mol/L的Na2SO4溶液中再交联1 h. 取出后用0.9% NaCl溶液冲洗， 放入冰箱中保存.
1.3 固定化颗粒性能评价
（1）稳定性： 向含100 mL蒸馏水的锥形瓶中加入30颗固定化颗粒， 于120 r/min（高速）、30℃摇床中培养48 h， 然后观察颗粒破裂情况.
（2）传质性能： 向高温灭菌的DTM液体培养基中加入30颗固定化颗粒， 于120 r/min、30℃摇床中培养48 h， 测定OD600.
（3） TN去除率： 向高温灭菌的DTM液体培养基中加入30颗固定化颗粒， 于120 r/min、30℃摇床中培养48 h， 测定TN去除率.
1.4 固定化颗粒环境因子耐受性分析
向100 mL灭菌DTM液体培养基（以NH4Cl为唯一氮源， 碳氮比为8）中加入30颗固定化颗粒，并放入恒温摇床中进行培养. 实验中设置不同的摇床转速（0、30、60、90、120 r/min）、不同的实验温度（10、15、20、25、30℃）、不同的实验pH值（5、6、7、9、11）. 考察48 h后， TN、NH4+-N、NO3–-N、NO2–-N的浓度变化、细菌生长情况和颗粒破裂情况， 进一步探究固定化颗粒对环境因子的耐受性.
1.5 实验指标分析
OD600由紫外分光光度法测定， TN采用碱式过硫酸钾消解紫外分光光度法， NH4+-N采用纳氏试剂法， NO3–-N采用紫外分光光度法， NO2–-N采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法测定.
2 结果与讨论
2.1 固定化载体配比优化
为了确定固定化载体质量分数的范围， 首先进行了预实验（见表1）. 根据预实验结果， 最终设置参数： PVA 浓度为8%、9%、10%， SA浓度为0.4%、0.6%、0.8%， 稻壳粉为0 g、0.5 g、1 g， 菌液量为5 mL、10 mL、15 mL， 进行正交试验， 以TN去除率作为响应值. 固定化载体配比优化正交试验见表2，其中因素A为PVA（%），因素B为SA（%），因素C为稻壳粉（g），因素D为菌液（mL）. 由表3实验结果可知，， 最优配比组合为8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻壳粉和10 mL的菌液， TN去除率为79.02%.而根据极差结果显示当配比组合为8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻壳粉和5 mL的菌液时， TN去除率最高. 但是实际实验结果表明， 理论最佳配比组合的TN去除率为77.81%， 小于以TN去除率为基准的最佳配比组合. 因此， 实验最终以8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻壳粉和10 mL的菌液为最佳载体配比. 此外， 由极差（R）分析可知， 4个因素对TN去除率的贡献程度为稻壳粉 > PVA > SA >菌液， 说明碳源是好氧反硝化过程中最重要的影响因素.
2.2 固定化颗粒性能评价
2.2.1 稳定性评价
稳定性是固定化效果的重要评价指标之一. 固定化颗粒需具有一定的机械强度以抵抗外界环境的冲击， 保护體内微生物不被破坏， 维持较高的微生物浓度， 提高其重复利用率. 因此， 对固定化颗粒进行48 h的高速（120 r/min）机械强度实验， 通过肉眼观察结果表明， 实验组中30颗固定化颗粒的外观未出现破裂、变形现象. 通过游标卡尺测量颗粒平均直径发现， 实验前和实验后的30颗固定化颗粒平均直径并未发生明显增大现象. 用玻璃片夹住小球进行按压， 发现颗粒仍具有与新鲜颗粒相同的弹性. 综上所述， 固定化颗粒具有良好的稳定性和一定的机械强度.
[14]张霓. 异养硝化-好养反硝化细菌Pseudomonas putida ZN1的脱氮及耐重金属特性研究 [D]. 太原： 太原理工大学， 2019.
[15]HUANG H K， TSENG S K. Nitrate reduction by Citrobacter diversus under aerobic environment [J]. Applied Microbiology & Biotechnology， 2001， 55（1）： 90-94.
[16]KUMAR M， LIN J G. Co-existence of anammox and denitrification for simultaneous nitrogen and carbon removal-Strategies and issues [J]. Journal of Hazardous Materials， 2010， 178（1）： 1-9.
[17]LEI Y， REN Y X， LIANG X， et al. Nitrogen removal characteristics of a heterotrophic nitrifier Acinetobacter junii YB and its potential application for the treatment of high-strength nitrogenous wastewater [J]. Bioresource Technology， 2015， 193： 227-233.
[18]XIE S G， ZHANG X J， WANG Z S. Temperature effect on aerobic denitrification and nitrification [J]. Journal of Environmental Sciences， 2003， 15（5）： 669-673.
[19]CHEN M， WANG W， FENG Y， et al. Impact resistance of different factors on ammonia removal by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium Aeromonas sp HN-02 [J]. Bioresource Technology， 2014， 167： 456-461.
[20]颜薇芝， 张汉强， 余从田， 等. 一株异养硝化好氧反硝化不动杆菌的分离及脱氮性能 [J]. 环境工程学报， 2017， 11（7）： 4419-4428.
[21]ZHAO B， HE Y L， HUANG J， et al. Heterotrophic nitrogen removal by Providencia rettgeri strain YL [J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology， 2010， 37（6）： 609-616.
[22]HE T X， LI Z L， SUN Q， et al. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by Pseudomonas tolaasii Y-11 without nitrite accumulation during nitrogen conversion [J]. Bioresource Technology， 2016， 200： 493-499.
（責任编辑： 张 晶）
关键词： 好氧反硝化菌; 固定化; 脱氮
中图分类号： X522 文献标志码： A DOI： 10.3969/j.issn.1000-5641.2021.04.001
Immobilization and efficacy of an aerobic denitrifier
YIN Chao1，2，3，4， LI Ying1，2，3，4， ZHANG Tingyue1，2，3，4， LIU Jiamin1，2，3，4， CHEN Tida1，2，3，4， CUI Dan1，2，3，4， HUANG Minsheng1，2，3，4
（1. Shanghai Key Laboratory for Urban Ecological Processes and Eco-Restoration， School of Ecological and Environmental Sciences， East China Normal University， Shanghai 200241， China; 2. Institute of EcoChongming， Shanghai 202162， China; 3. Shanghai Engineering Rearch Center of Biotransformation of Organic Solid Waste， Shanghai 200241， China; 4. Technology Innovation Center for Land Spatial EcoRestoration in Metropolitan Area （Ministry of Natural Resources）， Shanghai 200062， China）
Abstract： To improve the environmental tolerance and nitrogen removal efficiency of an aerobic denitrifier， polyvinyl alcohol （PVA）， sodium alginate （SA）， and rice hull powder were used as immobilized carriers for an aerobic denitrifier and the performance was subsequently evaluated. The results showed that the optimal ratio of immobilized particles was a mixture of 12% PVA， 8% sodium alginate （SA）， 0.5 g rice hull powder， and 10 mL bacterial solution. The immobilized particles had strong stability and mass transfer capability; the removal efficiency of TN was 89.35% ～ 90.12% over 48h. The immobilized particles had good tolerance to pH and rotating speed. When the pH was 11， the removal efficiency of TN was 90%. The removal efficiency of TN and NH4+-N was the highest （91.29% and 93.30%， respectively） when the speed was 120 r/min. The immobilized particles were not resistant to low temperatures （10℃ and 15℃）， and the TN removal efficiency was only about 20% at 10℃. The TN removal efficiency， however， achieved 90.59% at 30℃.
Keywords： aerobic denitrifer; immobilization; denitrification
0 引 言
好氧反硝化菌因同時具有硝化-反硝化功能、环境适应性强等特点而逐渐成为处理氮污染水体的新生力量[1-4]. 但是实际工程中若直接利用好氧反硝化菌修复水体， 很可能会因为水量波动、雨水冲刷、噬菌体吞噬、有毒物质抑制等因素导致菌体流失、死亡， 使得水体的修复效果变差[5-6]. 研究表明，利用包埋固定化技术固定微生物能够提高微生物抗冲击能力、防止微生物流失、提高脱氮效率[7-9]. 例如， 将海藻酸钠（SA）与Klebsiella sp. FC61细菌混合固定， NH4+-N去除率由61.37%提高到72.15%[10];利用固定化技术包埋活性污泥后， NH4+-N去除率能达100%[11]. Zhou等[12]利用氧化石墨烯（GO）对聚乙烯醇（PVA）进行改性， 发现改性组的COD去除率比未改性组提高10%. 现阶段研究微生物固定化主要还集中于价格昂贵的材料， 大规模使用的可操作性仍值得商榷. 探索利用廉价添加剂（稻壳粉）作为固定化材料， 不仅降低固定化成本、提供碳源、增加孔隙率， 而且能有效解决农林废弃物的问题. 基于此， 本研究以前期筛选出的好氧反硝化菌群LHJ-1为研究对象， 探讨以PVA、SA和稻壳粉为主要固定化材料对好氧反硝化菌的脱氮性能进行提升; 并探究固定化材料的最佳配比及固定化颗粒对环境因子（转速、pH值、温度）的耐受性进行分析， 旨在为好氧反硝化菌固定化技术在实际氮超标的城镇污水的应用上提供一定的理论指导.
1 材料与方法
1.1 好氧反硝化菌及DTM培养基
好氧反硝化菌主要来自龙泓涧底泥的富集培养. DTM液体培养基由C4H4Na2O4 0.405 1 g/L、KNO3 1.000 0 g/L、KH2PO4 0.007 0 g/L、K2HPO4 0.027 0 g/L、MgSO4 0.005 0 g/L和微量元素溶液（2.000 0 mL/L）组成. 其中， 微量元素溶液组成由EDTA 100.0 mg/L、ZnSO4 4.4 mg/L、CaCl2 11.0 mg/L、MnCl2·7H2O 10.2 mg/L、FeSO4·7H2O 10.0 mg/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 2.2 mg/L、CuSO4·5H2O 3.2 mg/L、CoCl2·6H2O 3.2 mg/L组成[13].
1.2 固定化颗粒制备
向含100 mL水烧杯中加入定量的PVA、SA、稻壳粉， 用无菌封口膜封住并置于水浴锅（85℃）中溶解. 待冷却至室温后加入定量菌液并缓慢搅拌， 避免产生气泡， 然后放入生化培养箱中培养4 h. 同时， 向饱和硼酸溶液中加入3%的CaCl2， 并调节pH值至6.5 ～ 7.0， 配制成交联剂. 培养4 h后用医用注射器将PVA-SA-稻壳粉混合液缓慢加入CaCl2-硼酸饱和溶液中， 并使用玻璃棒缓慢搅拌， 防止颗粒粘连， 交联4 h后转入0.5 mol/L的Na2SO4溶液中再交联1 h. 取出后用0.9% NaCl溶液冲洗， 放入冰箱中保存.
1.3 固定化颗粒性能评价
（1）稳定性： 向含100 mL蒸馏水的锥形瓶中加入30颗固定化颗粒， 于120 r/min（高速）、30℃摇床中培养48 h， 然后观察颗粒破裂情况.
（2）传质性能： 向高温灭菌的DTM液体培养基中加入30颗固定化颗粒， 于120 r/min、30℃摇床中培养48 h， 测定OD600.
（3） TN去除率： 向高温灭菌的DTM液体培养基中加入30颗固定化颗粒， 于120 r/min、30℃摇床中培养48 h， 测定TN去除率.
1.4 固定化颗粒环境因子耐受性分析
向100 mL灭菌DTM液体培养基（以NH4Cl为唯一氮源， 碳氮比为8）中加入30颗固定化颗粒，并放入恒温摇床中进行培养. 实验中设置不同的摇床转速（0、30、60、90、120 r/min）、不同的实验温度（10、15、20、25、30℃）、不同的实验pH值（5、6、7、9、11）. 考察48 h后， TN、NH4+-N、NO3–-N、NO2–-N的浓度变化、细菌生长情况和颗粒破裂情况， 进一步探究固定化颗粒对环境因子的耐受性.
1.5 实验指标分析
OD600由紫外分光光度法测定， TN采用碱式过硫酸钾消解紫外分光光度法， NH4+-N采用纳氏试剂法， NO3–-N采用紫外分光光度法， NO2–-N采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法测定.
2 结果与讨论
2.1 固定化载体配比优化
为了确定固定化载体质量分数的范围， 首先进行了预实验（见表1）. 根据预实验结果， 最终设置参数： PVA 浓度为8%、9%、10%， SA浓度为0.4%、0.6%、0.8%， 稻壳粉为0 g、0.5 g、1 g， 菌液量为5 mL、10 mL、15 mL， 进行正交试验， 以TN去除率作为响应值. 固定化载体配比优化正交试验见表2，其中因素A为PVA（%），因素B为SA（%），因素C为稻壳粉（g），因素D为菌液（mL）. 由表3实验结果可知，， 最优配比组合为8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻壳粉和10 mL的菌液， TN去除率为79.02%.而根据极差结果显示当配比组合为8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻壳粉和5 mL的菌液时， TN去除率最高. 但是实际实验结果表明， 理论最佳配比组合的TN去除率为77.81%， 小于以TN去除率为基准的最佳配比组合. 因此， 实验最终以8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻壳粉和10 mL的菌液为最佳载体配比. 此外， 由极差（R）分析可知， 4个因素对TN去除率的贡献程度为稻壳粉 > PVA > SA >菌液， 说明碳源是好氧反硝化过程中最重要的影响因素.
2.2 固定化颗粒性能评价
2.2.1 稳定性评价
稳定性是固定化效果的重要评价指标之一. 固定化颗粒需具有一定的机械强度以抵抗外界环境的冲击， 保护體内微生物不被破坏， 维持较高的微生物浓度， 提高其重复利用率. 因此， 对固定化颗粒进行48 h的高速（120 r/min）机械强度实验， 通过肉眼观察结果表明， 实验组中30颗固定化颗粒的外观未出现破裂、变形现象. 通过游标卡尺测量颗粒平均直径发现， 实验前和实验后的30颗固定化颗粒平均直径并未发生明显增大现象. 用玻璃片夹住小球进行按压， 发现颗粒仍具有与新鲜颗粒相同的弹性. 综上所述， 固定化颗粒具有良好的稳定性和一定的机械强度.
[14]张霓. 异养硝化-好养反硝化细菌Pseudomonas putida ZN1的脱氮及耐重金属特性研究 [D]. 太原： 太原理工大学， 2019.
[15]HUANG H K， TSENG S K. Nitrate reduction by Citrobacter diversus under aerobic environment [J]. Applied Microbiology & Biotechnology， 2001， 55（1）： 90-94.
[16]KUMAR M， LIN J G. Co-existence of anammox and denitrification for simultaneous nitrogen and carbon removal-Strategies and issues [J]. Journal of Hazardous Materials， 2010， 178（1）： 1-9.
[17]LEI Y， REN Y X， LIANG X， et al. Nitrogen removal characteristics of a heterotrophic nitrifier Acinetobacter junii YB and its potential application for the treatment of high-strength nitrogenous wastewater [J]. Bioresource Technology， 2015， 193： 227-233.
[18]XIE S G， ZHANG X J， WANG Z S. Temperature effect on aerobic denitrification and nitrification [J]. Journal of Environmental Sciences， 2003， 15（5）： 669-673.
[19]CHEN M， WANG W， FENG Y， et al. Impact resistance of different factors on ammonia removal by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium Aeromonas sp HN-02 [J]. Bioresource Technology， 2014， 167： 456-461.
[20]颜薇芝， 张汉强， 余从田， 等. 一株异养硝化好氧反硝化不动杆菌的分离及脱氮性能 [J]. 环境工程学报， 2017， 11（7）： 4419-4428.
[21]ZHAO B， HE Y L， HUANG J， et al. Heterotrophic nitrogen removal by Providencia rettgeri strain YL [J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology， 2010， 37（6）： 609-616.
[22]HE T X， LI Z L， SUN Q， et al. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by Pseudomonas tolaasii Y-11 without nitrite accumulation during nitrogen conversion [J]. Bioresource Technology， 2016， 200： 493-499.
（責任编辑： 张 晶）