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摘 要：实验通过卢戈氏碘液染色法和观察透明圈的方法，以蜡样芽孢杆菌0-9菌株为对照，对0-9菌株通过转座形成的突变体产生胞外淀粉酶能力的差异进行研究。实验结果发现，在固体淀粉培养基、30℃、24h培养的条件下，突变体36、38号菌产生淀粉酶的能力远大于对照组，突变体56、94号菌产生淀粉酶的能力远小于对照组。这些突变体可进一步为探索菌体胞外淀粉酶的分泌能力和菌体在小麦中的定植能力之间的关系做好准备，对小麦病虫害的防治也具有一定的意义。
关键词：卢戈氏碘液染色法 转座 蜡样芽胞杆菌0-9
1 前言
1.1生物防治
生物防治包括以虫治虫和以菌治虫。其主要措施是保护和利用自然界害虫的天敌、繁殖优势天敌、发展性激素防治虫害等。是人类依靠科技进步同病虫草害做斗争的重要措施之一。以菌治虫是80年代新兴的生物防治技术。它是利用昆虫的病原微生物杀死害虫。这类微生物包括细菌、真菌、病毒、原生物等，对人畜均无影响，使用的时候比较安全，无残留毒性，害虫对细菌也无法产生抗药性，因此，微生物农药的杀虫效果在所有防治技术中名列前茅。
1.2产胞外淀粉酶的菌株对生防的作用
1.2.1胞外淀粉酶的检测方法
淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称。淀粉酶能将可溶性淀粉、直链淀粉或者糖原分解为麦芽糖、糊精、葡萄糖等物质。淀粉与卢戈氏碘液产生反应生成蓝色物质，而被淀粉酶水解过生成的物质不会出现蓝色反应。由此可以在培养基中加入淀粉，然后用碘液染色，变蓝的地方说明有淀粉存在，没有变蓝的会出现一个透明的圈，这个范围内的淀粉被淀粉酶水解。故可以利用透明圈的大小来判断菌体产生淀粉酶的能力差异。
1.2.2 0-9菌株
蜡样芽孢杆菌，革兰阳性杆菌，大小为0.9-1.2μm×1.8-4.0μm，两端钝园，一般从短链到长链，培养6h后即可形成芽胞，芽胞位于菌体中央，椭圆形，不膨出。周生鞭毛。能运动。无荚膜。生长时需氧或兼性厌氧，在普通琼脂培养基中生长旺盛，形成较大、灰白色、表面粗糙似融蜡状菌落，因此而得名；在复杂培养基中能呈厌氧生长，葡萄糖和硝酸盐可促进厌氧生长；生长温度范围为5-30℃，10℃以下停止繁殖。其繁殖体不耐热，100℃经20min可被杀死。最适生长温度为28-35℃，生长酸碱度范围为pH4.3-9.0，生长最低水分活度为0.95。发酵葡萄糖，产酸并产气。
蜡样芽孢杆菌0-9菌株是1株从健康小麦植株中分离获得的有益芽孢杆菌，为小麦内生细菌，属革兰氏阳性蜡样芽胞杆菌，运动性强，具有产生葡聚糖酶、几丁质酶和蛋白酶等真菌细胞壁降解酶和铁载体的能力。该细菌对小麦纹枯病病原菌有抑制作用，抑菌率50%～70%，实验室条件下防治效果高达82.86 %。
2 材料与方法
2.1 供试材料
2.2.1 供试菌株
菌种0-9。从健康小麦体内分离得到，0-9为蜡样芽孢杆菌。菌株保存于-70℃ 超低温冰箱。
2.1.2 培养基
LB培养基：蛋白胨 10.0g，酵母提取物 5g，NaCl10.0 g，蒸馏水1000mL，PH7.0。一部分加入2%（w/w）琼脂用来制备固体LB培养基，另一部分制备液体LB培养基。灭菌条件：121℃ 、0.11Mpa灭菌20min。
淀粉培养基：可溶性淀粉 5.0g，加热至淀粉溶解，蛋白胨 10.0g，牛肉膏 3.0g，定容至1000 mL，PH7.0，加入2%（w/w）琼脂制备固体淀粉培养基。灭菌条件：121℃ 、0.11Mpa灭菌20min。
2.1.3 所用试剂
（1） 卢戈氏碘液 碘化钾 0.4g 碘片0.2g ③蒸馏水 60mL
（2） 红霉素
（3） 卡那霉素
2.1.4验器材
小试管 EP管 水浴箱 平皿 枪头 摇床 滴管 牙签 涂布棒 接种环
2.2 实验方法
2.2.1 菌株活化
配制LB液体培养基，灭菌三角瓶，200 mL LB液体培养基中接入取-70℃冰箱中保存的0-9 20μL，放入摇床，30℃ 200rpm下培养24h。
2.2.2菌株转座
配制LB固体培养基，倒平板。用无菌水稀释菌悬液至10-5、10-6濃度。吸取2 mL 10-6浓度的菌悬液涂布到平板上，一定要涂布均匀。将培养箱升温至46℃，将倒好的平板放入培养箱转座10小时。
2.2.3菌种转接
配制LB固体培养基，100 mL培养基中加入卡那霉素50μL，另外100 mL培养基中加入红霉素20μL，分别摇匀，倒平板，分别标明Erm1-5、Kan1-5。用灭菌好的牙签挑取单菌落，先在红霉素的平板上接种，然后在卡那霉素的平板上的相应位置接种。将接种好的平板放入30℃的培养箱中培养36小时。将培养好的菌放入超净台，挑取在加红霉素板上长而在加卡那霉素板上没有长的菌落，接种到新的板上。同样是先点种红霉素板，再点种卡那霉素板，放入30℃的培养箱中培养36小时。
2.2.4菌株的初筛
配制淀粉固体培养基，倒平板。用枪头吸取2μL已调好相同浓度的菌悬液点种到平板上，一个平板点种7个菌，每个菌重复三次，将点种好的平板放入30℃的培养箱培养24h。将培养好的平板中滴加卢戈氏碘液，染色。并量取不同菌落的透明圈的大小。
2.2.5菌株的复筛
为保证目标菌株的培养条件相同，将疑似菌株点种到同一个平板上，将点种好的平板放入30℃的培养箱培养24h。将培养好的平板中滴加卢戈氏碘液，染色。并量取不同菌落的透明圈的大小。
3结果现象与分析 3.1菌落染色结果
转座得到100个突变体，编号从1至100。0-9、 1-100号菌株培养24h后，对其进行碘液染色。结果显示，0-9和36、38、56、94号菌的透明圈出现较大差异（表1图：1 ）。菌株0-9在培养24h后形成的透明圈直径大小为14.5mm，菌株36、38、56、94形成的透明圈直径大小分别为20.7mm、19.2mm、9.0mm、9.6mm。
3.2结果分析
3.2.1 胞外淀粉酶产生
腊状芽孢杆菌0-9是从一株健康小麦植株中分离获得的有益芽孢杆菌，为小麦内生细菌，产生的胞外淀粉酶能够将小麦体内的淀粉分解为菌体能更好利用的物质（如：麦芽糖）。调控0-9菌分泌胞外淀粉酶的基因位于菌体的结构基因中。从实验的36、38号菌来看，它们的透明圈直径都远大于对照组0-9号菌株的透明圈直径。调控分泌胞外淀粉酶的基因遭到破坏之后可能导致产生的淀粉酶的量更大，但从56、94号菌来看，它们透明圈的直径又小与对照组0-9的透明圈直径。这说明基因被插入的位置不同也可能导致胞外淀粉酶的合成能力或者是分泌能力下降，最终导致产生的淀粉酶的量较对照组小。
因此，在细菌分泌胞外淀粉酶的量和多个因素有关。最主要的是芽孢杆菌内部的基因调控。淀粉酶基因本身的表达能力受到多个基因的调控，基因内部的调控基因、启动子受到破坏或者是被外源基因插入后都会导致淀粉酶产生的多少受到影响。芽孢杆菌膜系统的分泌能力和淀粉酶的运输能力都与最终检测到的透明圈直径的大小有关。
3.2.2 原因分析
36、38、56、94号菌株由0-9转座而来，36、38号菌产生的胞外淀粉酶的量远大于对照组的产生量，56、94号菌产生的胞外淀粉酶的量远小于对照组的产生量可能的原因如下：
（1）36、38号菌由于转座的基因强化了淀粉酶基因的启动子，使淀粉酶的转录与翻译量增加。转座的基因插入到控制芽孢杆菌膜系统合成的基因中，导致芽孢杆菌合成的膜为不完整或者是通透性比较大的膜，从而导致分泌的淀粉酶量较多。转座的基因插入到编码运输淀粉酶到膜外载体的基因中，导致载体的量增加或者运输能力增强，从而使胞外淀粉酶的量增加。
（2）56、94号菌由于转座的基因若化了淀粉酶基因的启动子，使淀粉酶的转录与翻译量减小。转座的基因插入到控制芽孢杆菌膜系统合成的基因中，导致芽孢杆菌合成的膜通透性更小，从而导致分泌的淀粉酶量较少。转座的基因插入到编码运输淀粉酶到膜外载体的基因中，导致载体的量减小或者运输能力减弱，从而使胞外淀粉酶的量降低。
（3）操作方面：由于各个菌株数目较多，不是同一批活化并测量，由于个人或者天气的原因，导致菌生长不是在恒定的条件下进行，从而导致菌的胞外淀粉酶的产生能力有差异。
参考文献
[1] 张炳欣， 张平， 陈晓斌， 等. 影响引入微生物根部定殖的因素 [J].应用生态学报， 2001， 11 （6）： 951–953.
[2] 刘建国， 裴炎， 丛威， 等. 蜡状芽孢杆菌S1 发酵条件的研究 [J].工业微生物， 2001， 31 （1）： 4–7.
[3] 焦文沁. 蜡样芽孢杆菌A-47 增效因子的筛选及增效机制初探 [D].北京： 中国农业大学， 2005.
[4] 王东明. 蜡样芽孢杆菌6371 的多效性及发酵条件的研究 [D]. 南京： 南京师范大学， 2004.
[5] Benhamou N， Kloepper J W， Ouadt-Hallman A， et al. Introduction of Defense-related Ultrastructural Modifications in Pea Root Tissues Inoculated with Endophytic Bacterial [J]. Plant Physiology， 1996， 112： 919–929.
[6] 文才藝， 吴元华， 田秀玲. 植物内生菌研究进展及其存在的问题
关键词：卢戈氏碘液染色法 转座 蜡样芽胞杆菌0-9
1 前言
1.1生物防治
生物防治包括以虫治虫和以菌治虫。其主要措施是保护和利用自然界害虫的天敌、繁殖优势天敌、发展性激素防治虫害等。是人类依靠科技进步同病虫草害做斗争的重要措施之一。以菌治虫是80年代新兴的生物防治技术。它是利用昆虫的病原微生物杀死害虫。这类微生物包括细菌、真菌、病毒、原生物等，对人畜均无影响，使用的时候比较安全，无残留毒性，害虫对细菌也无法产生抗药性，因此，微生物农药的杀虫效果在所有防治技术中名列前茅。
1.2产胞外淀粉酶的菌株对生防的作用
1.2.1胞外淀粉酶的检测方法
淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称。淀粉酶能将可溶性淀粉、直链淀粉或者糖原分解为麦芽糖、糊精、葡萄糖等物质。淀粉与卢戈氏碘液产生反应生成蓝色物质，而被淀粉酶水解过生成的物质不会出现蓝色反应。由此可以在培养基中加入淀粉，然后用碘液染色，变蓝的地方说明有淀粉存在，没有变蓝的会出现一个透明的圈，这个范围内的淀粉被淀粉酶水解。故可以利用透明圈的大小来判断菌体产生淀粉酶的能力差异。
1.2.2 0-9菌株
蜡样芽孢杆菌，革兰阳性杆菌，大小为0.9-1.2μm×1.8-4.0μm，两端钝园，一般从短链到长链，培养6h后即可形成芽胞，芽胞位于菌体中央，椭圆形，不膨出。周生鞭毛。能运动。无荚膜。生长时需氧或兼性厌氧，在普通琼脂培养基中生长旺盛，形成较大、灰白色、表面粗糙似融蜡状菌落，因此而得名；在复杂培养基中能呈厌氧生长，葡萄糖和硝酸盐可促进厌氧生长；生长温度范围为5-30℃，10℃以下停止繁殖。其繁殖体不耐热，100℃经20min可被杀死。最适生长温度为28-35℃，生长酸碱度范围为pH4.3-9.0，生长最低水分活度为0.95。发酵葡萄糖，产酸并产气。
蜡样芽孢杆菌0-9菌株是1株从健康小麦植株中分离获得的有益芽孢杆菌，为小麦内生细菌，属革兰氏阳性蜡样芽胞杆菌，运动性强，具有产生葡聚糖酶、几丁质酶和蛋白酶等真菌细胞壁降解酶和铁载体的能力。该细菌对小麦纹枯病病原菌有抑制作用，抑菌率50%～70%，实验室条件下防治效果高达82.86 %。
2 材料与方法
2.1 供试材料
2.2.1 供试菌株
菌种0-9。从健康小麦体内分离得到，0-9为蜡样芽孢杆菌。菌株保存于-70℃ 超低温冰箱。
2.1.2 培养基
LB培养基：蛋白胨 10.0g，酵母提取物 5g，NaCl10.0 g，蒸馏水1000mL，PH7.0。一部分加入2%（w/w）琼脂用来制备固体LB培养基，另一部分制备液体LB培养基。灭菌条件：121℃ 、0.11Mpa灭菌20min。
淀粉培养基：可溶性淀粉 5.0g，加热至淀粉溶解，蛋白胨 10.0g，牛肉膏 3.0g，定容至1000 mL，PH7.0，加入2%（w/w）琼脂制备固体淀粉培养基。灭菌条件：121℃ 、0.11Mpa灭菌20min。
2.1.3 所用试剂
（1） 卢戈氏碘液 碘化钾 0.4g 碘片0.2g ③蒸馏水 60mL
（2） 红霉素
（3） 卡那霉素
2.1.4验器材
小试管 EP管 水浴箱 平皿 枪头 摇床 滴管 牙签 涂布棒 接种环
2.2 实验方法
2.2.1 菌株活化
配制LB液体培养基，灭菌三角瓶，200 mL LB液体培养基中接入取-70℃冰箱中保存的0-9 20μL，放入摇床，30℃ 200rpm下培养24h。
2.2.2菌株转座
配制LB固体培养基，倒平板。用无菌水稀释菌悬液至10-5、10-6濃度。吸取2 mL 10-6浓度的菌悬液涂布到平板上，一定要涂布均匀。将培养箱升温至46℃，将倒好的平板放入培养箱转座10小时。
2.2.3菌种转接
配制LB固体培养基，100 mL培养基中加入卡那霉素50μL，另外100 mL培养基中加入红霉素20μL，分别摇匀，倒平板，分别标明Erm1-5、Kan1-5。用灭菌好的牙签挑取单菌落，先在红霉素的平板上接种，然后在卡那霉素的平板上的相应位置接种。将接种好的平板放入30℃的培养箱中培养36小时。将培养好的菌放入超净台，挑取在加红霉素板上长而在加卡那霉素板上没有长的菌落，接种到新的板上。同样是先点种红霉素板，再点种卡那霉素板，放入30℃的培养箱中培养36小时。
2.2.4菌株的初筛
配制淀粉固体培养基，倒平板。用枪头吸取2μL已调好相同浓度的菌悬液点种到平板上，一个平板点种7个菌，每个菌重复三次，将点种好的平板放入30℃的培养箱培养24h。将培养好的平板中滴加卢戈氏碘液，染色。并量取不同菌落的透明圈的大小。
2.2.5菌株的复筛
为保证目标菌株的培养条件相同，将疑似菌株点种到同一个平板上，将点种好的平板放入30℃的培养箱培养24h。将培养好的平板中滴加卢戈氏碘液，染色。并量取不同菌落的透明圈的大小。
3结果现象与分析 3.1菌落染色结果
转座得到100个突变体，编号从1至100。0-9、 1-100号菌株培养24h后，对其进行碘液染色。结果显示，0-9和36、38、56、94号菌的透明圈出现较大差异（表1图：1 ）。菌株0-9在培养24h后形成的透明圈直径大小为14.5mm，菌株36、38、56、94形成的透明圈直径大小分别为20.7mm、19.2mm、9.0mm、9.6mm。
3.2结果分析
3.2.1 胞外淀粉酶产生
腊状芽孢杆菌0-9是从一株健康小麦植株中分离获得的有益芽孢杆菌，为小麦内生细菌，产生的胞外淀粉酶能够将小麦体内的淀粉分解为菌体能更好利用的物质（如：麦芽糖）。调控0-9菌分泌胞外淀粉酶的基因位于菌体的结构基因中。从实验的36、38号菌来看，它们的透明圈直径都远大于对照组0-9号菌株的透明圈直径。调控分泌胞外淀粉酶的基因遭到破坏之后可能导致产生的淀粉酶的量更大，但从56、94号菌来看，它们透明圈的直径又小与对照组0-9的透明圈直径。这说明基因被插入的位置不同也可能导致胞外淀粉酶的合成能力或者是分泌能力下降，最终导致产生的淀粉酶的量较对照组小。
因此，在细菌分泌胞外淀粉酶的量和多个因素有关。最主要的是芽孢杆菌内部的基因调控。淀粉酶基因本身的表达能力受到多个基因的调控，基因内部的调控基因、启动子受到破坏或者是被外源基因插入后都会导致淀粉酶产生的多少受到影响。芽孢杆菌膜系统的分泌能力和淀粉酶的运输能力都与最终检测到的透明圈直径的大小有关。
3.2.2 原因分析
36、38、56、94号菌株由0-9转座而来，36、38号菌产生的胞外淀粉酶的量远大于对照组的产生量，56、94号菌产生的胞外淀粉酶的量远小于对照组的产生量可能的原因如下：
（1）36、38号菌由于转座的基因强化了淀粉酶基因的启动子，使淀粉酶的转录与翻译量增加。转座的基因插入到控制芽孢杆菌膜系统合成的基因中，导致芽孢杆菌合成的膜为不完整或者是通透性比较大的膜，从而导致分泌的淀粉酶量较多。转座的基因插入到编码运输淀粉酶到膜外载体的基因中，导致载体的量增加或者运输能力增强，从而使胞外淀粉酶的量增加。
（2）56、94号菌由于转座的基因若化了淀粉酶基因的启动子，使淀粉酶的转录与翻译量减小。转座的基因插入到控制芽孢杆菌膜系统合成的基因中，导致芽孢杆菌合成的膜通透性更小，从而导致分泌的淀粉酶量较少。转座的基因插入到编码运输淀粉酶到膜外载体的基因中，导致载体的量减小或者运输能力减弱，从而使胞外淀粉酶的量降低。
（3）操作方面：由于各个菌株数目较多，不是同一批活化并测量，由于个人或者天气的原因，导致菌生长不是在恒定的条件下进行，从而导致菌的胞外淀粉酶的产生能力有差异。
参考文献
[1] 张炳欣， 张平， 陈晓斌， 等. 影响引入微生物根部定殖的因素 [J].应用生态学报， 2001， 11 （6）： 951–953.
[2] 刘建国， 裴炎， 丛威， 等. 蜡状芽孢杆菌S1 发酵条件的研究 [J].工业微生物， 2001， 31 （1）： 4–7.
[3] 焦文沁. 蜡样芽孢杆菌A-47 增效因子的筛选及增效机制初探 [D].北京： 中国农业大学， 2005.
[4] 王东明. 蜡样芽孢杆菌6371 的多效性及发酵条件的研究 [D]. 南京： 南京师范大学， 2004.
[5] Benhamou N， Kloepper J W， Ouadt-Hallman A， et al. Introduction of Defense-related Ultrastructural Modifications in Pea Root Tissues Inoculated with Endophytic Bacterial [J]. Plant Physiology， 1996， 112： 919–929.
[6] 文才藝， 吴元华， 田秀玲. 植物内生菌研究进展及其存在的问题