【摘 要】
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目的 构建雌激素受体α亚基(ERα)下调的人成骨样细胞模型.方法 采用计算机辅助设计并合成ERα特异性小干扰RNA(siRNA)前体基因后,定向克隆入pSilencer 4.1-CMV质粒中,构建重
【机 构】
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广州医学院第二附属医院核医学科医学影像实验室,中心大学第一附属医院耳鼻咽喉科,中山大学基础医学院生理教研室
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目的 构建雌激素受体α亚基(ERα)下调的人成骨样细胞模型.方法 采用计算机辅助设计并合成ERα特异性小干扰RNA(siRNA)前体基因后,定向克隆入pSilencer 4.1-CMV质粒中,构建重组的ERα siRNA表达载体并测序鉴定.由脂质体介导重组质粒稳定转染人成骨样细胞株MG63,潮霉素筛选阳性抗性克隆细胞.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测ERα基因在人成骨样细胞株MG63内的表达,抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合体法(ABC)分析ERα蛋白在人成骨样细胞株MG63内的表达与定位.MTT法测ERα基因被特异性下调后对MG63细胞生长的影响.流式细胞术分析ERα siRNA对人成骨样细胞株MG63细胞生长周期的影响.采用改良Gomori氏钙钻法分析ERα siRNA对人成骨样细胞株MG63表达碱性磷酸酶的影响.结果 构建表达ERαsiRNA的重组真核表达载体,并成功地下调了人成骨样细胞株MG63的ERα亚基基因,其中MG63细胞的G1期为68.6%,G2期为17.6%,S期为13.8%;ERα siRNA MG63细胞的G1期为68,6%,G2期为16.8%,S期为14.6%.而ERα siRNA下调人成骨样细胞株MG63的ERα亚基对细胞的生长特性无明显影响.结论 成功地构建了ERα下调的人成骨样细胞模型,该模型为进一步研究雌激素及其受体对骨代谢影响的分子机制提供了基础材料.
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